Discrimintion og kartlegging av primær og behandlet transkripsjoner i mais mitokondrie bruke en sirkulær RT-PCR-basert strategi
Summary
Vi presenterer en sirkulær RT-PCR-basert strategi ved å kombinere sirkulær RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ‘ polyphosphatase og Northern blot. Denne protokollen inkluderer en normalisering skritt for å minimere påvirkning av ustabile 5 ‘ trifosfat, og det er egnet for diskriminerende og kartlegging den primære og bearbeidede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais mitokondrie.
Abstract
I anlegget mitokondrier, noen steady-state transkripsjoner har 5 ‘ trifosfat avledet fra transkripsjon innvielse (Primær transkripsjoner), mens de andre inneholder 5 ‘ monofosfat generert post-transcriptionally (bearbeidet transkripsjoner). Å diskriminere mellom de to typene av transkripsjoner, har flere strategier er utviklet, og de fleste av dem er avhengige av tilstedeværelse/fravær av 5 ‘ trifosfat. Imidlertid er trifosfat på primær 5 ‘ Termini ustabil, og det hindrer en klar diskriminering av de to typer transkripsjoner. For systematisk å differensiere og kartlegge de primære og behandlede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais mitokondrie, har vi utviklet en sirkulær RT-PCR (cRT-PCR)-basert strategi ved å kombinere cRT-PCR, RNA 5 ‘ polyphoshpatase behandling, kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR), og Northern blot. Som en forbedring, inkluderer denne strategien en RNA normalisering skritt for å minimere påvirkning av ustabile 5 ‘ trifosfat.
I denne protokollen er den beriket mitokondrie RNA pre-behandlet av RNA 5 ‘ polyphosphatase, som omdanner 5 ‘ triphsophate til monofosfat. Etter circularization og omvendt transkripsjon, de to cDNAs avledet fra 5 ‘ polyphosphatase-behandlet og ikke-behandlet RNAs er normalisert av mais 26S eldre rRNA, som har en bearbeidet 5 ‘ end og er ufølsom for 5 ‘ polyphosphatase. Etter normalisering blir de primære og behandlede transkripsjoner diskriminert ved å sammenligne cRT-PCR-og RT-qPCR-produkter som er Hentet fra de behandlede og ikke-behandlede RNAs. Transkripsjon Termini bestemmes av kloning og sekvensering av cRT-PCR produkter, og deretter verifisert av Northern blot.
Ved å bruke denne strategien, har de fleste steady-state transkripsjoner i mais mitokondrie blitt bestemt. På grunn av den kompliserte transkripsjon mønster av noen mitokondrie gener, noen steady-state transkripsjoner ikke var differensiert og/eller kartlagt, selv om de ble oppdaget i en Northern blot. Vi er ikke sikker på om denne strategien er egnet til å diskriminere og kart steady-state transkripsjoner i andre plante mitokondrier eller i plastids.
Introduction
I Plant mitokondrier, er mange modne og forløper RNAs akkumulert som flere isoformene, og steady-state transkripsjoner kan deles inn i to grupper basert på forskjellen på deres 5 ‘ ender1,2,3, firetil. Den primære transkripsjoner har 5 ‘ trifosfat ender, som er avledet fra transkripsjon innvielse. Til sammenligning har de behandlede transkripsjoner 5 ‘ monofosfat generert av post-transcriptional prosessering. Diskriminering og kartlegging av de to typer transkripsjoner er viktig å avdekke den molekylære mekanismer underliggende transkripsjon og transkripsjon slutten modning.
For å skille mellom de primære og behandlede transkripsjoner i anlegget mitokondrie, fire store strategier er utviklet. Den første strategien er å pre-behandle mitokondrie RNAs med Tobacco acid pyrophosphatase (TAP), som konverterer 5 ‘ trifosfat å monofosfat og gjør primær transkripsjoner å bli circularized av RNA ligase. Transkripsjon forekomster av trykk-behandlet og ikke-behandlet RNA prøver blir deretter sammenlignet med rask forsterkning av cDNA ender (Race) eller sirkulær RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den andre strategien, behandles transkripsjoner først utarmet fra mitokondrie RNAs bruker Terminator 5 ‘-fosfat-avhengige exonuclease (Tex), og den primære transkripsjoner venstre blir deretter kartlagt ved primer forlengelse analyse5,6 . Den tredje strategien er å pre-cap den primære transkripsjoner bruker guanylyl glutamyltransferase, og deretter plasseringen av triphosphated 5 ‘ Termini bestemmes av primer forlengelse sammen med ribonuklease eller S1 nuklease beskyttelse analyse7,8 ,9. Forskjellig fra de avhengig av tilstedeværelse/fravær av 5 ‘ trifosfat, den fjerde strategien kombinerer in vitro transkripsjon, site-regissert mutagenese, og primer forlengelsen analyse for å karakterisere antatte arrangører og bestemme transkripsjon Innvielse nettsteder8,10,11. Ved å bruke disse strategiene, mange primære og bearbeidet transkripsjoner har blitt bestemt i anlegget mitokondrier.
Imidlertid har flere studier rapportert at 5 ‘ trifosfat av primære transkripsjoner var ustabile, og de ble lett konverteres til monofosfat for ukjent grunn2,4,12,13. Dette problemet hindrer en klar diskriminering av de to typer transkripsjoner ved hjelp av teknikker avhengig av tilstedeværelse/fravær av 5 ‘ trifosfat, og tidligere forsøk på å systematisk diskriminere mellom de primære og bearbeidede transkripsjoner i anlegget mitokondrier mislyktes2,12.
I denne protokollen kombinerer vi cRT-PCR, RNA 5 ‘ polyphosphatase behandling, RT-qPCR og Northern blot for systematisk å skille de primære og behandlede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais (Zea Mays) mitokondrie (figur 1). cRT-PCR tillater samtidig kartlegging av 5 ‘ og 3 ‘ ekstremiteter av et RNA molekyl, og det er vanligvis tilpasset kart transkripsjon Termini i planter2,12,14,15. RNA 5 ‘ polyphosphatase kan fjerne to fosfater fra triphosphated 5 ‘ Termini, som gjør at de primære utskriftene er tilgjengelige for selv ligation av RNA-ligase. Tidligere studier viste at modne 26s rRNA i mais hadde behandlet 5 ‘ Terminus, og det var ufølsom for RNA 5 ‘ polyphosphatase1,16. For å minimere påvirkningen av ustabile trifosfat på primær 5 ‘ Termini, de 5 ‘ polyphosphatase og ikke-behandlet RNAs er normalisert av eldre 26s rRNA, og den primære og bearbeidede transkripsjoner er så differensiert ved å sammenligne cRT-PCR-produkter Hentet fra de to RNA-prøvene. Den cRT-PCR kartlegging og diskriminering resultater er verifisert av Northern blot og RT-qPCR, henholdsvis. Til slutt, alternative primere brukes til å forsterke de transkripsjoner påvist i Northern blot, men ikke av cRT-PCR. Ved å bruke denne cRT-PCR-basert strategi, har de fleste steady-state transkripsjoner i mais mitokondrie blitt differensiert og kartlagt1.
Protocol
Representative Results
Discussion
I en tidligere studie, total og mitokondrie RNAs fra celle suspensjon kultur Arabidopsis ble brukt til å kartlegge mitokondrie transkripsjon Termini av CRT-PCR, og lignende resultater ble innhentet12. Men bare beriket mitokondrie RNA ble brukt til å kartlegge mitokondrie transkripsjon Termini i mange andre studier1,2,3,9. Vi fant ut at berikelse av mitokondrie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 31600250, Y.Z.), vitenskap og teknologi prosjekter i Guangzhou City (Grant no. 201804020015, H.N.), og China Agricultural Research system (Grant no. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
Riferimenti
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
