多尾根结鱼巨噬细胞的快速隔离
Summary
在这里，我们提出了一个机械分离协议，以快速分离巨噬细胞从背根结条，用于方位和功能分析。
Abstract
研究周围神经损伤后背根神经痛的背根神经瘤的免疫细胞和感觉神经元之间的分子和细胞相互作用的兴趣越来越大。外周单细胞，包括巨噬细胞，已知通过噬菌体、抗原表达和细胞因子释放对组织损伤作出反应。新出现的证据已经牵连到背根神经性巨噬细胞对神经损伤背景下的神经病痛发展和斧道修复的贡献。快速的声叫（或”快速隔离”），背根神经质噬细胞在神经损伤的情况下的反应需要识别未知的神经免疫因素。在这里，我们演示了我们的实验室如何使用无酶的机械解离方案快速有效地从背根结节分离巨噬细胞。样品一直保存在冰上，以限制细胞压力。与标准酶协议相比，该协议的耗时要少得多，并常用于荧光激活细胞分拣分析。
Introduction
现在有相当多的证据表明，免疫细胞在外周神经损伤1，2后造成神经病变疼痛。外周单细胞，包括成熟的巨噬细胞，已知通过噬菌体、抗原表达和细胞因子释放对组织损伤和全身感染作出反应。平行神经损伤引起的微胶质激活在脊髓背角，巨噬细胞在背根神经神经损伤（DRG）后也显著扩大后神经损伤3，4。值得注意的是，有越来越多的兴趣，以确定宏噬细胞是否有助于神经病变后，周围神经损伤后，与感觉神经元在DRG 5，6，7相互作用8,9,10,11.此外，最近的研究也涉及DRG巨噬细胞在神经损伤12、13后对斧道修复的贡献。另一项研究进一步表明，巨噬细胞亚群（即CD11b+Ly6CHi和CD11b+Ly6C低/-细胞）在机械超敏14中可能扮演不同的角色。因此，在神经损伤的情况下快速对DRG巨噬细胞的反应进行表示，可以帮助我们识别导致神经病痛的神经免疫因素。
按照惯例，在DRG中分离巨噬细胞的协议涉及多个步骤，包括酶消化15，16。该技术通常非常耗时，对于大规模实验来说可能成本高昂。虽然温和的消化与胶原酶II型（4毫克/mL）和消血酶II型（4.7毫克/mL）20分钟建议之前15，可以想象，细胞后暴露于这种酶是容易细胞损坏或细胞死亡，这可能导致低产量。此外，酶质量的差异可能进一步影响这一过程的效率。更重要的是，暴露于酶消化的巨噬细胞可能被无情地刺激，因此可能与体内状态非常不同。这些变化可能使功能性研究的结果复杂化。
在这里，我们描述了一种无酶协议，利用机械解散在4°C下快速分离DRG巨噬细胞。样品保存在冰上，以限制细胞压力。因此，我们的方法提供了保持隔离一致性的优势，并且分离的细胞可能更健康，刺激更少。我们进一步提出证据，通过荧光激活细胞分拣（FACS）分析验证分离细胞的质量。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们介绍了一种新方法，有效地丰富了从小鼠DRG分离的巨噬细胞。分离DRG免疫细胞的传统方法需要酶消化15，18，现在在我们的协议中用机械均质代替，以限制不需要的细胞损伤，提高产量。因此，新协议省时少得多。更重要的是，酶消化可以刺激巨噬细胞并改变分子特征。相比之下，我们的机械方法极大地限制了细胞压力。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了麻醉教育与研究基金会（XY）的支持;UCSF麻醉和围手术期护理部（XY）;和 1R01NS100801-01 （GZ）。这项研究部分得到了HDFCCC细胞分析共享资源实验室的一部分支持，得到了NIH（P30CA082103）的资助。
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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