ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離
Summary
ここでは、表現型および機能解析のための後部根神経節からマクロファージを迅速に分離するための機械的解離プロトコルを提示する。
Abstract
末梢神経損傷後の後の後の後の後の後の後の後部根神経節の免疫細胞と感覚ニューロン間の分子と細胞の相互作用を研究する関心が高まっています。マクロファージを含む末梢単球細胞は、有毒症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷に応答することが知られている。新たな証拠は、神経因性疼痛の発症および神経損傷の文脈における軸線修復に対する背中根神経節マクロファージの寄与に関与している。神経損傷の文脈における後部根神経神経マクロファージの反応を迅速に表現(または「急速に単離」)することは、未知の神経免疫因子を同定することが望まれている。ここでは、酵素フリーの機械的解離プロトコルを使用して、マクロファージを後部根神経節から迅速かつ効果的に分離する方法を示します。サンプルは細胞のストレスを制限するために全体を通して氷の上に保たれます。このプロトコルは、標準的な酵素プロトコルに比べてはるかに時間がかからず、蛍光活性化細胞選別分析に日常的に使用されています。
Introduction
免疫細胞が末梢神経損傷1、2に続く神経因性疼痛に寄与するというかなりの証拠がある。成熟マクロファージを含む末梢単球細胞は、有病動細胞症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷および全身感染に応答することが知られている。脊髄後角における神経損傷誘発ミクログリア活性化と並行して、後部根神経節(DRG)におけるマクロファージも神経損傷3,4後に有意に膨張する。特に、マクロファージがDRG5,6,7の感覚ニューロンと相互作用することにより末梢神経損傷後の神経因性疼痛発症に寄与するかどうかを判断する関心が高まっている。8,9,10歳,11.さらに、最近の研究はまた、神経損傷後の軸線修復におけるDRGマクロファージの寄与を含む12,13.別の研究はさらに、マクロファージ亜集団(すなわち、CD11b+Ly6ChiおよびCD11b+Ly6C低/-細胞)が機械的過敏症14において異なる役割を果たしうる可能性があることを示唆している。したがって、神経損傷の文脈におけるDRGマクロファージの応答を迅速に表現することは、神経因性疼痛に寄与する神経免疫因子を同定するのに役立つ可能性がある。
従来、DRG中のマクロファージを単離するプロトコルは、酵素消化15、16を含む複数のステップを含む。この手法は、多くの場合、時間がかかり、大規模な実験にはコストがかかる可能性があります。コラゲナーゼII型(4mg/mL)とジスパーゼ型II(4.7mg/mL)を20分間推奨していたが、この酵素に曝露した後の細胞は細胞損傷や細胞死に起こりやすく、低につながる可能性がある。収量。さらに、バッチからバッチへの酵素の品質の違いは、このプロセスの効率にさらに影響を与える可能性があります。さらに重要なことは、酵素消化にさらされたマクロファージは、望ましくない刺激を受ける可能性があるため、生体内状態とは大きく異なる可能性があります。この変更は、機能的研究の結果を複雑にする可能性があります。
ここでは、機械的解離を用いてDRGマクロファージを4°Cで迅速に単離する酵素フリープロトコルについて説明する。サンプルは細胞のストレスを制限するために氷の上に保たれます。その結果、我々のアプローチは、単離の一貫性を維持するための利点を提供し、単離された細胞は、おそらくより健康で、刺激が少ない。さらに、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析により単離細胞の品質を検証するエビデンスを提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、マウスDRGから分離されたマクロファージを効果的に濃縮する新しい方法を紹介する。DRG免疫細胞を単離する従来のアプローチは、酵素消化15、18を必要とし、これは現在、望ましくない細胞損傷を制限し、収率を増加させるために、我々のプロトコルで機械的均質化に置き換えられています。したがって、新しいプロトコルは、はるかに?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、によってサポートされました: 麻酔教育研究のための財団 (XY);麻酔および周術的ケアのUCSF部門 (XY);1R01NS100801-01(GZ)を使用しています。本研究は、NIH(P30CA082103)の助成を通じて、HDFCCC細胞分析共有資源施設の一部を支援した。
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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