Hurtig isolering af dorsale Rodganglion makrofager
Summary
Her præsenterer vi en mekanisk dissociations protokol til hurtigt at isolere makrofager fra rygroden ganglion til fænotypebestemmelse og funktionel analyse.
Abstract
Der er voksende interesse for at studere den molekylære og cellulære interaktioner mellem immunceller og sensoriske neuroner i rygroden ganglier efter perifer nerveskade. Perifere monocytiske celler, herunder makrofager, er kendt for at reagere på en vævsskade gennem fagocytose, antigen præsentation, og cytokinfrigivelse. Nye beviser har impliceret bidraget fra dorsale root basale ganglier makrofager til neuropatiske smerte udvikling og axonal reparation i forbindelse med nerveskade. Hurtigt fænotypebestemmelse (eller “hurtig isolering af”) responsen af dorsale root basale ganglier makrofager i forbindelse med nerveskade ønskes at identificere de ukendte Neuro immune faktorer. Her demonstrerer vi, hvordan vores laboratorium hurtigt og effektivt isolerer makrofager fra dorsalrodsganglier ved hjælp af en enzym fri mekanisk dissociations protokol. Prøverne holdes på is hele for at begrænse cellulære stress. Denne protokol er langt mindre tidskrævende i forhold til standard enzymatisk protokol og er rutinemæssigt blevet brugt til vores fluorescens-aktiverede celle sortering analyse.
Introduction
Der er nu betydelige beviser for, at immunceller bidrager til neuropatiske smerter efter perifer nerveskade1,2. Perifere monocytiske celler, herunder modne makrofager, er kendt for at reagere på vævsskade og systemisk infektion gennem fagocytose, antigen præsentation, og cytokinfrigivelse. Parallelt med nerveskade-induceret microglia aktivering i rygmarvs dorsale horn, makrofager i rygroden basale ganglier (DRG) også ekspandere betydeligt efter nerveskade3,4. Især er der stigende interesse for at afgøre, om makrofager bidrage til neuropatiske smerte udvikling efter perifer nerveskade ved at interagere med sensoriske neuroner i DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Endvidere implicerer nylige undersøgelser også bidraget fra DRG-makrofager i den axonale reparation efter nerveskade12,13. En anden undersøgelse tyder endvidere på, at makrofag subpopulationer (dvs., CD11b+Ly6CHi og CD11b+Ly6Clav/- celler) kan spille en anden rolle i den mekaniske overfølsomhed14. Derfor, hurtigt fænotypebestemmelse reaktionen af DRG makrofager i forbindelse med nerveskade kan hjælpe os med at identificere Neuro immune faktorer, som bidrager til neuropatiske smerter.
Konventionelt, protokollen til at isolere makrofager i DRG involverer flere trin, herunder enzymatisk fordøjelse15,16. Teknikken er ofte tidskrævende og kan være bekostelig for storstilede eksperimenter. Selv om mild fordøjelse med kollagenase type II (4 mg/ml) og dispase type II (4,7 mg/ml) i 20 min blev anbefalet tidligere15, er det tænkeligt, at celler efter eksponeringen for dette enzym er tilbøjelige til celle skade eller celledød, hvilket kan føre til lav Udbytte. Desuden kan forskellen i kvaliteten af enzymer fra batch til parti yderligere påvirke effektiviteten af denne proces. Endnu vigtigere er det, at makrofager, der eksponeres for enzym fordøjelsen, kan blive uønsket stimuleret og dermed kan være meget forskellig fra in vivo-status. Ændringerne kan potentielt komplicere resultatet af den funktionelle undersøgelse.
Her beskriver vi en enzym-fri protokol til hurtigt at isolere DRG-makrofager ved 4 °C ved hjælp af mekanisk dissociation. Prøverne holdes på is for at begrænse cellulære stress. Som følge heraf giver vores tilgang en fordel for at opretholde ensartethed i isolationen, og de isolerede celler er formentlig sundere og mindre stimulerede. Vi fremlægger yderligere dokumentation for at validere kvaliteten af de isolerede celler med fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introducerer vi en ny metode til effektivt at berige isolerede makrofager fra mus DRG. Den konventionelle tilgang til at isolere DRG immunceller kræver enzymatisk fordøjelse15,18, som nu er erstattet med mekanisk homogenisering i vores protokol for at begrænse uønskede celleskader og øge udbyttet. Derfor er den nye protokol langt mindre tidskrævende. Endnu vigtigere, enzym fordøjelsen kan stimulere makrofager og ændre den molekylære signatur. I mods?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af: Foundation for anæstesi uddannelse og forskning (XY); UCSF-departementet for anæstesi og perioperative pleje (XY); og 1R01NS100801-01 (GZ). Denne undersøgelse blev delvist støttet af HDFCCC laboratorium for celle analyse faciliteten for delte ressourcer gennem et tilskud fra NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
Riferimenti
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
