العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة
Summary
هنا نقدم بروتوكول التفكك الميكانيكية لعزل الضامة بسرعة من العقدة الجذر الظهري للنماذج الظاهرية والتحليل الوظيفي.
Abstract
هناك اهتمامات متزايدة لدراسة التفاعلات الجزيئية والخلوية بين الخلايا المناعية والخلايا العصبية الحسية في العقد ية الجذر الظهري بعد إصابة العصب المحيطي. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة، تستجيب لإصابة الأنسجة من خلال داء الفيغوسية، وعرض مستضد، وإطلاق سراح السيتوكين. وقد تورطت الأدلة الناشئة مساهمة الضامة جذور الظهر في تطوير الألم العصبي وإصلاح axonal في سياق إصابة الأعصاب. الفينول بسرعة (أو “العزلالسريع من”) استجابة الضامة الجذور الظهرية في سياق إصابة الأعصاب هو المطلوب لتحديد عوامل المناعة العصبية غير معروف. هنا نبين كيف أن مختبرنا يعزل الضامة بسرعة وفعالية من العقد الجذرية الظهرية باستخدام بروتوكول فك نأفة ميكانيكية خالية من الإنزيمات. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد في جميع أنحاء للحد من الإجهاد الخلوي. هذا البروتوكول هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة بالمقارنة مع البروتوكول الأنزيمي القياسية، وقد استخدمت بشكل روتيني لتحليلنا فرز الخلايا تنشيط الفلورة.
Introduction
هناك الآن أدلة كبيرة على أن الخلايا المناعية تسهم في الألم العصبي بعد إصابة العصب المحيطي1،2. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة الناضجة، تستجيب لإصابة الأنسجة والعدوى الجهازية من خلال داء البلغم، وعرض المستضد، وإطلاق السيتوكين. بالتوازي مع تنشيط microglia الناجم عن إصابة الأعصاب في القرن الظهري الشوكي ، توسع الضامة في العقد ية الجذر الظهرية (DRG) بشكل كبير بعد إصابة الأعصاب3،4. وتجدر الإشارة إلى أن هناك مصالح متزايدة لتحديد ما إذا كانت الضامة تسهم في نمو الألم العصبي بعد إصابة الأعصاب المحيطية من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الحسية في DRG5،6،7، 8 , 9 , 10 سنوات , 11.وعلاوة على ذلك، والدراسات الحديثة تورط أيضا مساهمة الضامة DRG في إصلاح axonal بعد إصابة الأعصاب12،13. وتشير دراسة أخرى كذلك إلى أن التجمعات السكانية الفرعية في الضامة (أي CD11b+Ly6Chi وCD11b+Ly6Cمنخفضة/- الخلايا) قد تلعب دوراً مختلفاً في فرط الحساسية الميكانيكية14. ولذلك، فإن الفينول بسرعة استجابة الضامة DRG في سياق إصابة الأعصاب قد تساعدنا على تحديد عوامل المناعة العصبية التي تسهم في الألم العصبي.
تقليديا ، فإن بروتوكول عزل الضامة في DRG ينطوي على خطوات متعددة بما في ذلك الهضم الأنزيمي15،16. وغالبا ما تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا ويمكن أن تكون مكلفة بالنسبة للتجارب الواسعة النطاق. على الرغم من أن الهضم الخفيف مع الكولاجين النوع الثاني (4 ملغ / مل) وديسباس النوع الثاني (4.7 ملغ / مل) لمدة 20 دقيقة أوصى سابقا15، فمن المتصور أن الخلايا بعد التعرض لهذا الإنزيم عرضة لتلف الخلايا أو موت الخلايا ، والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفرق في نوعية الإنزيمات من دفعة إلى دفعة قد يؤثر بشكل أكبر على كفاءة هذه العملية. والأهم من ذلك، الضامة المعرضة لهضم الإنزيم قد تكون محفزة بشكل غير مرغوب فيه، وبالتالي يمكن أن تكون مختلفة جدا عن الوضع في الجسم الحي. وقد تؤدي التغييرات إلى تعقيد نتائج الدراسة الوظيفية.
هنا نقوم بوصف بروتوكول خال من الإنزيم لعزل الضامة DRG بسرعة في 4 درجة مئوية باستخدام التفكك الميكانيكي. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد للحد من الإجهاد الخلوي. ونتيجة لذلك، يوفر نهجنا ميزة للحفاظ على اتساق العزلة، ويفترض أن الخلايا المعزولة هي أكثر صحة وأقل تحفيزا. كما نقدم الأدلة للتحقق من جودة الخلايا المعزولة مع تحليل فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم طريقة جديدة لإثراء بفعالية الضامة المعزولة من الماوس DRG. النهج التقليدي لعزل الخلايا المناعية DRG يتطلب الهضم الأنزيمي15،18، والتي يتم استبدالها الآن مع التجانس الميكانيكية في بروتوكولنا للحد من تلف الخلايا غير المرغوب فيها وزيادة الغلة. ولذلك، فإن ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم الدراسة من قبل: مؤسسة التثقيف والبحوث التخدير (XY)؛ قسم التخدير والرعاية المحيطة بالجراحة (XY) في جامعة كاليفورنيا في لوس أنسياف. و1R01NS100801-01 (GZ). وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مختبر HDFCCC لتحليل الخلايا مرفق الموارد المشتركة من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
Riferimenti
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
