Snabb isolering av dorsala root ganglion makrofager
Summary
Här presenterar vi en mekanisk dissociation protokoll för att snabbt isolera makrofager från dorsala root ganglion för fenotypning och funktionell analys.
Abstract
Det finns växande intressen att studera molekylära och cellulära interaktioner mellan immunceller och sensoriska nervceller i dorsala root ganglier efter perifer nervskada. Perifera monocytiska celler, inklusive makrofager, är kända för att reagera på en vävnadsskada genom fagocytos, antigen presentation, och cytokin release. Framväxande bevis har implierat bidraget av dorsala root ganglier makrofager till neuropatisk smärt utveckling och axonal reparation i samband med nervskada. Snabbt fenotypning (eller “snabb isolering av”) svaret av dorsala root ganglier makrofager i samband med nervskada önskas för att identifiera de okända neuroimmunfaktorerna. Här visar vi hur vårt labb snabbt och effektivt isolerar makrofager från dorsala rotganglier med hjälp av ett enzymfritt mekaniskt dissociationprotokoll. Proverna hålls på is hela för att begränsa cellulära stress. Detta protokoll är mycket mindre tidskrävande jämfört med det vanliga enzymatiska protokollet och har rutinmässigt använts för vår Fluorescensaktiverade cell sorterings analys.
Introduction
Det finns nu betydande belägg för att immunceller bidrar till neuropatisk smärta efter perifer nervskada1,2. Perifera monocytiska celler, inklusive mogna makrofager, är kända för att reagera på vävnadsskada och systemisk infektion genom fagocytos, antigen presentation, och cytokin release. Parallellkoppling av nervskada-inducerad mikroglia aktiveringen i ryggraden dorsala horn, makrofager i dorsala root ganglier (DRG) också expandera signifikant efter nervskada3,4. Särskilt, det finns växande intressen att avgöra om makrofager bidra till neuropatisk smärta utveckling efter perifer nervskada genom att interagera med sensoriska nervceller i DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Dessutom, nyare studier också impalerar bidraget av DRG makrofager i axonal reparation efter nervskada12,13. En annan studie tyder vidare på att makrofage subpopulationer (dvs CD11b+Ly6CHi och CD11b+Ly6CLow/- cells) kan spela en annan roll i den mekaniska överkänslighet14. Därför, snabbt fenotypning svaret av DRG makrofager i samband med nervskada kan hjälpa oss att identifiera Neuroimmunologiska faktorer som bidrar till neuropatisk smärta.
Konventionellt, protokollet att isolera makrofager i DRG innebär flera steg inklusive enzymatisk nedbrytning15,16. Tekniken är ofta tidskrävande och kan bli kostsam för storskaliga experiment. Även om mild matsmältning med kollagenas typ II (4 mg/ml) och dispas typ II (4,7 mg/ml) för 20 min rekommenderades tidigare15, är det tänkbart att celler efter exponering för detta enzym är benägna att cellskada eller celldöd, vilket kan leda till låg Avkastning. Dessutom kan skillnaden i kvaliteten på enzymer från parti till parti ytterligare påverka effektiviteten i denna process. Ännu viktigare, makrofager utsätts för enzym nedbrytning kan vara oönskat stimuleras och därmed kan vara mycket olika från in-vivo status. Förändringarna kan potentiellt komplicera resultatet av den funktionella studien.
Här beskriver vi ett enzymfritt protokoll för att snabbt isolera DRG-makrofager vid 4 ° c med mekanisk dissociation. Proverna hålls på is för att begränsa cellulär stress. Som ett resultat, vårt tillvägagångssätt ger en fördel att bibehålla konsekvensen av isoleringen, och de isolerade cellerna är förmodligen friskare och mindre stimulerade. Vi presenterar ytterligare bevis för att validera kvaliteten på de isolerade cellerna med Fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här introducerar vi en ny metod för att effektivt berika isolerade makrofager från Mouse DRG. Den konventionella metoden för att isolera DRG immunceller kräver enzymatisk nedbrytning15,18, som nu ersätts med mekanisk homogenisering i vårt protokoll för att begränsa oönskade cellskador och öka avkastningen. Därför är det nya protokollet mycket mindre tidskrävande. Ännu viktigare, enzym nedbrytning kan stimulera makrofager och ändra den molekylära…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av: Stiftelsen för anestesi utbildning och forskning (XY); UCSF Institutionen för anestesi och perioperativ vård (XY); och 1R01NS100801-01 (GZ). Denna studie stöddes delvis av HDFCCC laboratorium för cell analys gemensamma resurser Facility genom ett bidrag från NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
Riferimenti
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
