Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal
Summary
O sistema esferóide tridimensional do ensaio da angiogênese da cocultura é projetado imitar a angiogênese fisiológica. Os esferoides da co-cultura são dados forma por dois precursores vasculares humanos da pilha, por ecfcs e por MSCS, e incorporados no gel do colagénio. O novo sistema é eficaz para avaliar moduladores angiogênicos e fornece informações mais relevantes para o estudo in vivo.
Abstract
Estudos no campo da angiogênese têm sido agressivamente crescendo nas últimas décadas com o reconhecimento de que a angiogênese é uma marca registrada de mais de 50 diferentes condições patológicas, como a artrite reumatóide, oculopatia, doenças cardiovasculares e metástase tumoral. Durante o desenvolvimento da angiogênese, é crucial o uso de sistemas de ensaio in vitro com tipos de células apropriadas e condições adequadas para refletir o processo de angiogênese fisiológica. Para superar as limitações de sistemas de ensaio de angiogênese in vitro atuais usando principalmente células endoteliais, desenvolvemos um sistema de ensaio de sprouting de cocultura (3D) de cortura em 3 dimensões. Os esferoides da cocultura foram produzidos por dois precursores vasculares humanos da pilha, as pilhas de formação da colônia endothelial (ecfcs) e as pilhas de haste mesenquimais (MSCS) com uma relação de 5 a 1. Os esferóides ECFCs + MSCs foram incorporados na matriz de colágeno tipo I para imitar o ambiente extracelular in vivo. Um registrador de pilha tempo real foi utilizado para observar continuamente a progressão do sprouting angiogênico dos esferoides para 24 h. a técnica de rotulagem fluorescente da pilha viva foi aplicada igualmente para tratar a localização de cada tipo da pilha durante a formação do sprout. O potencial angiogênico foi quantificado contando o número de brotos e medindo o comprimento acumulado de brotos gerados a partir de esferóides individuais. Cinco esferóides selecionados aleatoriamente foram analisados por grupo experimental. Experimentos de comparação demonstraram que os esferóides ECFCs + MSCs mostraram maior número de brotos e comprimento acumulado do broto em comparação com os esferóides somente com ECFCs. Bevacizumab, um inibidor da angiogênese aprovado pela FDA, foi testado com o sistema de ensaio de cocultura recém-desenvolvida para verificar seu potencial para a tela de drogas antiangiogênicas. O valor do IC50 para esferóides ecfcs + MSCS comparados com os esferóides somente com ecfcs foi mais próximo da concentração plasmática efetiva de bevacizumab obtida do modelo de camundongo do tumor do Xenoenxerto. O presente estudo sugere que o sistema de ensaio de angiogênese esferóide 3D ECFCs + MSCs é relevante para a angiogênese fisiológica e pode prever uma concentração plasmática efetiva antes de experimentos com animais.
Introduction
Aproximadamente 500 milhões pessoas em todo o mundo deverão se beneficiar da terapia moduladora da angiogênese para doenças associadas à malformação vascular, como artrite reumatóide, oculopatia, doenças cardiovasculares e metástases tumorais1. Assim, o desenvolvimento de fármacos que controlam a angiogênese tornou-se uma importante área de pesquisa na indústria farmacêutica. Durante o processo de desenvolvimento de fármacos, o estudo animal in vivo é necessário para explorar os efeitos dos candidatos a drogas sobre funções fisiológicas e interações sistêmicas entre órgãos. No entanto, as questões éticas e de custo aumentaram as preocupações em relação aos experimentos com animais2. Portanto, os sistemas de ensaio in vitro melhorados são necessários para obter dados mais precisos e previsíveis que levam à melhor tomada de decisão antes dos experimentos com animais. Os ensaios atuais de angiogênese in vitro geralmente medem a proliferação, invasão, migração ou formação de estruturas tubulares de células endoteliais (ECs) semeadas em placas de cultura bidimensionais (2D)3. Estes ensaios de angiogênese 2D são rápidos, simples, quantitativos e rentáveis, e contribuíram significativamente para a descoberta de fármacos moduladores de angiogênese. No entanto, continuam a ser melhoradas várias questões.
Tais sistemas de ensaio in vitro 2D não podem refletir eventos complexos em várias etapas da angiogênese que ocorre em condições fisiológicas in vivo, levando a resultados imprecisos que causam discrepâncias entre os dados do ensaio in vitro e os desfechos do ensaio clínico4. as condições de cultura 2D também induzem a mudança de fenótipos celulares. Por exemplo, após a proliferação em placas da cultura 2D, o ECS tem um phenotype celular fraco como manifestado pela expressão reduzida de CD34 e por diversos sinais que governam respostas celulares5,6. Para superar as limitações do 2D sistemas cultura-baseados do ensaio da angiogênese, os sistemas tridimensionais do ensaio da angiogênese do esferóide (3D) foram desenvolvidos. A brotação seguida de formação de estruturas tubulares de esferóides formados por ECS refletem os processos de neovascularização in vivo7,8. Assim, o ensaio de angiogênese esferóide 3D tem sido considerado um sistema de ensaio eficaz para a triagem de drogas pró-ou antiangiogénese potencial.
A maioria dos ensaios de angiogênese esferóide 3D utilizam apenas ECs, principalmente células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) ou células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMECs) para se concentrar na resposta celular dos ECs durante a angiogênese. No entanto, os capilares sanguíneos são compostos por dois tipos de células: ECs e pericytes. A elaboração da interação bidirecional entre ECS e pericitos é fundamental para a integridade e a função vascular apropriadas. Várias doenças, como AVC hereditário, retinopatia diabética e malformação venosa, estão associadas à densidade de pericyte alterada ou à diminuição do apego de pericyte ao endotélio9. Os pericytes também são conhecidos como um elemento-chave do processo angiogênico. Os pericytes são recrutados para estabilizar estruturas de vasos recém-formadas por ECs. Neste sentido, o ensaio de angiogênese esferóide de mono-cultura não incorpora pericitos7,10. Conseqüentemente, os esferoides da cocultura formados por ECS e por pericitos podem fornecer uma aproximação valiosa para imitar mais pròxima eventos angiogênicos fisiológicos.
O presente estudo objetivou desenvolver um ensaio de angiogênese de cocultura em 3D com uma combinação de células de conformação de colônias endoteliais humanas (ECFCs) e células-tronco mesenquimais (MSCs) para refletir mais de perto na angiogênese in vivo. O sistema esferóide da co-cultura como um conjunto in vitro da respresentação de um vaso sanguíneo normal foi estabelecido primeiramente por korff et al. em 200111. Combinaram HUVECs e pilhas humanas do músculo liso da artéria do cordão umbilical (HUSMCs), e demonstraram que a cocultura de duas pilhas vasculares maduras diminuiu o potencial sprouting. Os ECS maduros (HUVECs) são conhecidos por perder progressivamente sua capacidade de proliferar ediferenciar, oque afeta negativamente suasrespostas deangiogênese12,13. Células perivasculares maduras (HUSMCs) podem causar inativação de células endoteliais através da revogação da responsividade do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)11. A principal diferença entre korff e nosso sistema de cocultura esferóide é o tipo de célula usado. Nós aplicamos dois precursores vasculares, ECFCs e MSCs, para estabelecer um sistema apropriado do ensaio da angiogênese para telar e investigar agentes pró-ou-antiangiogénicos. Os ECFCs são o precursor dos ECs. Os ECFCs têm uma capacidade de proliferação robusta em comparação com os ECs14maduros, que permitem superar a limitação do ECS. Os ecfcs contribuem para a formação de novos vasos em muitas condições fisiopatológicas pós-natais15,16,17. As MSCS são células-tronco pluripotentes que têm a capacidade de se diferenciar em pericytes, contribuindo assim para a angiogênese18,19.
Em relatos prévios, ecfcs e MSCS mostraram efeitos sinergéticos na formação de tubos in vitro20, na neovascularização invivo 21,22, e melhoraram a reperfusão de tecidos isquêmicos,23. No presente estudo, ECFCs e MSCs foram utilizados para formar esferóides de cocultura e embutidos em gel de colágeno tipo I para refletir um ambiente in vivo 3D. O colágeno é considerado como um dos principais constituintes da matriz extracelular (ECM) ao redor do ECs25. O ECM desempenha um papel crítico na regulação do comportamento celular26. O protocolo de ensaio proposto aqui pode ser realizado de forma fácil e rápida no prazo de dois dias, utilizando técnicas laboratoriais comuns. Para o seguimento eficaz da pilha durante o processo sprouting, cada tipo da pilha pode cDNAs ser etiquetado e monitorado usando um registrador da pilha do tempo real. O sistema novo-estabelecido do ensaio da angiogênese do esferóide da co-cultura 3D é projetado aumentar a sensibilidade para avaliar moduladores angiogênico potenciais e fornecer a informação previsível adiantado do estudo in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente estudo apresenta um melhor sistema de ensaio de angiogênese in vitro utilizando esferóides de cocultura formados por dois progenitores de células vasculares humanas, ecfcs e MSCS. o sistema esferóide da co-cultura pode imitar in vivo a formação vascular do sprout, que é realizado pela interação e incorporação entre células endoteliais e pericytes. Comparado a outros ensaios in vitro de angiogênese que refletem apenas a angiogênese mediada pelo ECs, este sistema de ensaio de cocultura é mais repr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção (17172MFDS215) do Ministério da segurança alimentar e drogas, a Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) subsídio financiado pelo governo da Coréia (MSIP) (2017R1A2B4005463), e do programa de pesquisa científica básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiada pelo Ministério da educação (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
Riferimenti
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