Adoptivimmunterapi af iNKT-celler i glucose-6-fosfatisomerase (G6PI)-Induceret RA-mus
Summary
Denne protokol bruger G6PI blandede peptider til at konstruere leddegigt modeller, der er tættere på den menneskelige leddegigt i CD4+ T celler og cytokiner. Høj renhed invariant naturlige dræber T-celler (hovedsagelig iNKT2) med specifikke fænotyper og funktioner blev opnået ved in vivo induktion og in vitro rensning for adoptivimmunterapi.
Abstract
Leddegigt (RA) er en kompleks kronisk inflammatorisk autoimmun sygdom. Sygdommens patogenese er relateret til invariant naturlige dræber T (iNKT) celler. Patienter med aktiv RA præsentere færre iNKT celler, defekt celle funktion, og overdreven polarisering af Th1. I denne undersøgelse blev der etableret en RA-dyremodel ved hjælp af en blanding af hGPI325-339 og hGPI469-483 peptider. INKT-cellerne blev fremstillet ved in vivo induktion og in vitrorensning efterfulgt af infusion i RA-mus til adoptivimmunterapi. In vivo imaging system (IVIS) sporing viste, at iNKT celler var hovedsageligt fordelt i milten og leveren. På dag 12 efter celleterapi, sygdomsprogression bremset betydeligt, de kliniske symptomer blev lindret, forekomsten af iNKT celler i thymus steget, andelen af iNKT1 i thymus faldt, og niveauet af TNF-α, IFN-γ, og IL-6 i serum faldt. Adoptivimmunterapi af iNKT-celler genoprettede balancen mellem immunceller og korrigerede den overdrevne betændelse i kroppen.
Introduction
Leddegigt (RA) er en autoimmun sygdom karakteriseret ved kronisk, progressiv invasiv med 0,5-1% incidens1,2. Den underliggende patogenese tilskrives den unormale spredning af autoreaktive CD4+ og CD8+ T-celler, manifesteret ved en stigning i andelen af CD4+IFN-γ+ og CD4+IL-17A+ T-celler og det reducerede antal CD4+IL-4+ og CD4+CD25+FoxP3+ T-celler. Derfor øges udskillelse af inflammatoriske cytokiner, og en overdreven inflammatorisk reaktion ødelægger den indfødte balance og tolerancefunktion i kroppens immunsystem. Desuden hjælperen T lymfocyt (Th) 1 celler, der trænger ind i leddet forværre inflammatoriske respons og ledskader. Derfor er hæmningaf overdreven inflammatorisk respons og genskabelse af immuntolerance og immunbalance nøglen til behandling af RA3,4.
INKT-cellerne har både NK-celle- og T-cellefunktioner og -egenskaber. INKT-cellerne har en særskilt, invariant T-cellereceptor (TCR) α-kæde med begrænsede TCR β-kæderepertoirer5 og genkender glycolipidantigenet, der præsenteres af det store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I molekyle CD1d på overfladen af de antigenpræsenterende celler. Mitsuo et al.6 opdaget et stort antal iNKT celler og funktionelle defekter i mange autoimmune sygdomme, herunder RA. Aurore et al.7 viste, at iNKT-celler har en positiv effekt på opretholdelsen af autoimmun tolerance, og at sygdommen afhjælpes, når antallet og funktionen af iNKT-celler genoprettes. Desuden fandt Miellot-Gafsou et al.8, at iNKT-celler ikke kun ophævede sygdommen, men også øgede sygdommens progression. Disse modstridende resultater tyder på, at iNKT-celler er heterogene T-celler, og funktionen af forskellige undersæt kan vendes. I en klinisk undersøgelse af RA korrelerer hyppigheden af iNKT-celler med scoren for sygdomsaktiviteten9. Resultaterne bekræftede også, at hyppigheden af iNKT blev nedsat hos RA-patienter, antallet af CD4+IFN-γ+ T-celleundersæt steg, og de sekretoiniske niveauer af inflammatoriske cytokiner IFN-γ og TNF-α steg10,11. Desuden undersøgte Sharif et al.12 type 1-diabetes (T1D) og fandt ud af, at selektiv infusion af iNKT-celler opregulerede ekspressionen af den inflammatoriske cytokin IL-4, opretholdt immuntolerance og forhindrede udviklingen af type 1-diabetes. Derfor øger adoptivinfusion af specifikke iNKT-celler eller målrettet aktivering af iNKT-celler niveauet af iNKT-celler hos RA-patienter, hvilket kan være et gennembrud i RA-behandling.
Cellulære immunterapi er i øjeblikket af stor interesse og har været meget udbredt i kræftbehandling. INKT-celler er imidlertid sjældne, heterogene immunregulerende celler (kun 0,3 % af det samlede antal PbMC’er)13, hvilket begrænser potentielle kliniske anvendelser. Disse celler er hovedsageligt opdelt i tre delpopulationer: 1) iNKT1 celler, som har et højt udtryk for promyelocytisk leukæmi zink-finger protein (PLZF) og T-box transskription faktor (T-bet); 2) iNKT2 celler med mellemliggende udtryk for PLZF og GATA bindende protein 3 (GATA3); 3) iNKT17 celler med lavt udtryk for PLZF og retinoid-relaterede forældreløse nukleare receptor (ROR)-γt at udskille IFN-γ, IL-4, og IL-1714. Aktiverede iNKT celler udskiller Th1, Th2, og Th17-lignende cytokiner, som bestemmer de forskellige immunmodulerende virkninger af iNKT celler15. De immunmodulerende og immunoterapeutiske virkninger af specifik aktivering af forskellige delpopulationer af iNKT-celler er forskellige. Derfor kan udvælgelsen af specifikke fænotyper af iNKT-celler (hovedsagelig iNKT2) med antiinflammatoriske funktioner til at regulere kroppens immunrespons korrigere immunubalancen og immunlidelserne hos RA.
Etableringen af en ideel dyremodel er af stor betydning for behandling og undersøgelse af RA patogenese. I øjeblikket, de mest almindeligt anvendte og modne dyremodeller omfatter kollagen-induceret arthritis, adjuverende arthritis, zymosan-induceret arthritis, og polysaccharid-induceret arthritis16–17. Men der er ingen model, der fuldt ud kan simulere alle funktionerne i menneskelige RA. Type II kollagen-induceret arthritis (CIA) er en klassisk arthritis model. CIA er induceret af immunisering af mus med type II kollagen-specifikke monoklonale antistoffer, der afspejler antistof afhængighed af denne sygdom model. Benurs et al. beskrev en model med en systemisk immunrespons på glukose-6-fosfat isomerase (G6PI), som inducerer perifer symmetrisk polyarthritis hos modtagelige musestammer18,19. I denne model, udviklingen af gigt afhænger af T-celler, B-celler, og medfødte immunitet18,19,20. Horikoshi21 fandt, at RA modeller som følge af immunisering af DBA/1 mus med G6PI polypeptid fragmenter ligner mere menneskelige RA i form af CD4+ T celler og cytokiner (dvs. IL-6 og TNF-α) end CIA modeller. For at øge den stimulerende virkning på TCR anerkendelse site, blandet polypeptid fragmenter af G6PI (hGPI325-339 og hGPI469-483) blev brugt til at immunisere DBA/1 mus til at konstruere RA musemodel. Succesraten for denne fremgangsmåde kan høj, fordi hGPI325-339 og hGPI469-483 er immundominerende for I-A q-begrænsede T-cellereaktioner. Derfor kan denne model simulere overproliferation af CD4+ T-celler og iNKT-cellefejl hos RA-patienter22. Grundforskningen i RA immunpatologi lagde grunden til vores videre dybdegående undersøgelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
iNKT celler er særlige T-celler, bro medfødte og adaptive immunitet og er hovedsageligt udviklet fra CD4++/ CD8+ thymocytter. iNKT celler har forskellige immunreguleringsfunktioner og interagere med andre immunceller ved direkte kontakt og sekretorer af forskellige cytokiner23, påvirker dendritiske celler (DC’ er), makrofager, neutrofiler, B-celler, T-celler, og NK celle differentiering og udvikling24….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vores undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges og universitetets videnskab og teknologi centrale forskningsprojekt i Hebei-provinsen (ZD2017009) og Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Vi er taknemmelige for deres støtte.
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
Riferimenti
- Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis. Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).
- Cross, M., et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).
- Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis. Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Bianca, B. S. Unraveling Natural Killer T-Cells Development. Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).
- Mitsuo, A., et al. Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases. Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).
- Miellot, A., et al. Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).
- Miellot-Gafsou, A., et al. Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Ming, M., et al. Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b. Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).
- Ming, M., et al. Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis. Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).
- Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).
- Gapin, L. Development of invariant natural killer T cells. Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).
- Kwon, D. I., Lee, Y. J. Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells. Immune Network. 17 (6), (2017).
- Thapa, P., et al. The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1. Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ. Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).
- Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis. Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).
- Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice. Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).
- Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase. Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).
- Kamradt, T., Schubert, D. The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis. Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).
- Horikoshi, M., et al. Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis. PlosOne. 7 (12), 51215 (2012).
- Zhang, X. J., et al. Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice. Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).
- Motohashi, S., Nakayama, T. Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer. Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).
- Jung, S., et al. The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis. Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).
- Luc, V. K., Lan, W. Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity. Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).
- Chiba, A., et al. Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide. Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Bruns, L., et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice. Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).
- Parietti, V., et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).
- Yoshida, Y., et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model. Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).
- Chen, D., et al. Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells. International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).
