Forbedring af små RNA-SEQ: mindre bias og bedre påvisning af 2 '-O-methyl-RNAs
Summary
Vi præsenterer en detaljeret lille RNA bibliotek reparation protokol med mindre bias end standardmetoder og en øget følsomhed for 2 ‘-O-methyl RNAs. Denne protokol kan følges ved hjælp af hjemmelavede reagenser for at spare omkostninger eller bruge kits til bekvemmelighed.
Abstract
Studiet af små RNAs (sRNAs) ved næste generations sekvensering (NGS) udfordres af bias-problemer under biblioteks forberedelsen. Flere typer sRNA såsom plante microRNAs (miRNAs) bære en 2 ‘-O-methyl (2 ‘-OMe) modifikation på deres 3 ‘ Terminal nucleotid. Denne modifikation tilføjer en anden vanskelighed, da det hæmmer 3 ‘ adapter ligation. Vi har tidligere demonstreret, at modificerede versioner af ‘ TruSeq (TS) ‘ protokollen har mindre bias og en forbedret påvisning af 2 ‘-OMe RNAs. Her beskriver vi i detaljer protokol ‘ TS5 ‘, som viste den bedste samlede præstation. TS5 kan følges enten ved hjælp af hjemmelavede reagenser eller reagenser fra TS kit, med samme ydeevne.
Introduction
Små RNAs (sRNAs) er involveret i kontrollen af en mangfoldighed af biologiske processer1. Eukaryotic Regulatory sRNAs er typisk mellem 20 og 30 NT i størrelse; de tre hovedtyper er microRNAs (miRNA), Piwi-interagerende RNAs (piRNA) og små forstyrrende RNAs (siRNA). Afvigende miRNA udtryk niveauer har været impliceret i en række forskellige sygdomme2. Dette understreger betydningen af miRNAs i sundhed og sygdom og kravet om nøjagtige, kvantitative forskningsværktøjer til at opdage sRNAs i almindelighed.
Next-Generation sekventering (NGS) er en meget anvendt metode til at studere srnas. De vigtigste fordele ved NGS sammenlignet med andre tilgange, såsom kvantitative PCR-eller microarray-teknikker (qPCR), er, at det ikke har brug for en priori-viden om sRNA-sekvenser og derfor kan bruges til at opdage nye RNAs, og at det desuden lider mindre baggrunds signal og mætningseffekter. Yderligere, det kan detektere enkelt nukleotid forskelle og har en højere gennemløb end mikroarrays. Men NGS har også nogle ulemper; omkostningerne ved en sekvens kørsel er fortsat relativt høje, og den Step-proces, der kræves for at konvertere en prøve til et bibliotek til sekvensering, kan introducere bias. I en typisk sRNA-Biblioteks forberedelsesproces er en 3 ‘ adapter først ligeret til sRNA (ofte gel-renset fra Total RNA) ved hjælp af en afkortet version af RNA-ubiquitinligase 2 (RNL2) og en præadenyleret 3 ‘ adapter (figur 1) i fravær af ATP. Dette øger effektiviteten af Srna-adapter ligering og reducerer dannelsen af sidereaktioner såsom Srna cirkularisering eller koncatemerisering. Efterfølgende, en 5 ‘ adapter er ligeret af RNA ubiquitinligase 1 (RNL1), efterfulgt af reverse transkriptionen (RT) og PCR amplifikation. Alle disse trin kan indføre bias3,4. Læse numrene afspejler derfor muligvis ikke de faktiske sRNA-udtryks niveauer, hvilket fører til kunstige, metode afhængige udtryks mønstre. Specifikke sRNAs kan være enten over-eller underrepræsenteret i et bibliotek, og stærkt underrepræsenterede sRNAs kan undslippe afsløring. Situationen er særlig kompliceret med plante miRNAs, siRNAs i insekter og planter, og piRNAs i insekter, nematoder og pattedyr, hvor 3 ‘ Terminal nucleotid har en 2 ‘-O-methyl (2 ‘-OMe) modifikation1. Denne ændring hæmmer kraftigt 3 ‘ adapter ligering5, hvilket gør biblioteket forberedelse til disse typer af RNA en vanskelig opgave.
Tidligere arbejde viste, at adapter ligering introducerer alvorlig bias, på grund af RNA sekvens/struktureffekter6,7,8,9,10,11. Trin nedstrøms for adapter ligering såsom reverse transkription og PCR bidrager ikke signifikant til bias6,11,12. Ligering bias er sandsynligvis på grund af det faktum, at adapter molekyler med en given sekvens vil interagere med Srna molekyler i reaktionsblandingen til dannelse af co-folder, der kan enten føre til gunstige eller ugunstige konfigurationer for ligering (figur 2). Data fra Sorefan et al7 antyder, at RNL1 foretrækker en enkelt strandede sammenhæng, mens RNL2 foretrækker en dobbelt streng til ligation. Det forhold, at adapter/sRNA Co-fold strukturer er bestemt af den specifikke adapter og sRNA sekvenser forklarer, hvorfor specifikke sRNA er over-eller underrepræsenteret med en given adapter sæt. Det er også vigtigt at bemærke, at der inden for en række sRNA biblioteker, der skal sammenlignes, de samme adapter sekvenser bør anvendes. Faktisk er det tidligere blevet bemærket, at skiftende adaptere ved indførelsen af forskellige stregkode sekvenser ændrer Mirna profiler i sekvensering biblioteker9,13.
Randomisering af adapter sekvenser i nærheden af ligationskrydset reducerer sandsynligvis disse skævheder. Sorefan og kolleger7 brugte adaptere med 4 tilfældige nukleotider på deres ekstremiteter, udpegede “high definition” (HD) adaptere, og viste, at brugen af disse adaptere fører til biblioteker, der bedre afspejler sande Srna ekspressionsniveauer. Nyere arbejde bekræftet disse observationer og afslørede, at den randomiserede region ikke behøver at være støder op til ligering Junction11. Denne nye type adaptere blev “MidRand”-adaptere. Tilsammen viser disse resultater, at forbedret adapter design kan reducere bias.
I stedet for at ændre adapterne kan bias undertrykkes gennem optimering af reaktions forholdene. Polyethylenglycol (peg), et makromolekyle-fortrængning-middel, der vides at øge ligations effektiviteten14, har vist sig at reducere bias15,16betydeligt. Baseret på disse resultater, flere “Low bias” kits dukkede op på markedet. Disse omfatter kits, der bruger PEG i ligations reaktionerne, enten i kombination med klassiske adaptere eller HD-adaptere. Andre kits undgå ligering helt, og brug 3 ‘ polyadenylering og skabelon Skift til 3 ‘ og 5 ‘ adapter addition, henholdsvis12. I endnu en strategi, 3 ‘ adapter ligering efterfulgt af en cirkularisering skridt, og dermed udelade 5 ‘ adapter ligering17.
I en tidligere undersøgelse, vi søgte efter en sRNA bibliotek forberedelse protokol med de lavest mulige niveauer af bias og den bedste påvisning af 2 ‘-OMe RNAs12. Vi testede nogle af de ovennævnte ‘ low bias ‘ kits, som havde en bedre påvisning af 2 ‘-OMe RNAs end standardprotokollen (TS). Overraskende dog, efter modifikation (brug af randomiserede adaptere, PEG i ligations reaktioner og fjernelse af overskydende 3 ‘ adapter ved rensning) sidstnævnte udkonkurreret de andre protokoller til påvisning af 2 ‘-OMe RNAs. Her beskriver vi i detaljer en protokol baseret på TS-protokollen, ‘ TS5 ‘, som havde den bedste samlede opdagelse af 2 ‘-OMe RNAs. Protokollen kan følges ved hjælp af reagenser fra TS kit og en reagens fra ‘ NF ‘ kit eller, for at spare penge, ved hjælp af hjemmelavede reagenser, med samme ydeevne. Vi leverer også en detaljeret protokol til rensning af sRNA fra Total RNA og fremstilling af præadenyleret 3 ‘ adapter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lille RNA-bibliotek forberedelse forbliver udfordrende på grund af bias, primært introduceret under adapter ligering trin. RNAs med en 2 ‘-OMe modifikation på deres 3 ‘ ende, såsom plante miRNAs, piRNA i insekter, nematoder og pattedyr, og små interfererende RNAs (siRNA) i insekter og planter er særligt vanskeligt at studere, fordi 2 ‘-OMe modifikation hæmmer 3 ‘ adapter ligation. En række løsninger er blevet foreslået i litteraturen til at forbedre sRNA bibliotek forberedelse protokoller, men de fleste kommerc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det nationale center for videnskabelig forskning (CNRS), den franske alternative energier og Atomenergikommissionen (CEA) og Paris-Sud Universitet. Alle Biblioteks forberedelser, Illumina sekvensering og bioinformatik analyser for denne undersøgelse blev udført på I2BC Next-generations sekventering (NGS) facilitet. Medlemmerne af I2BC NGS-faciliteten er anerkendt til kritisk læsning af manuskriptet og nyttige forslag.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
Riferimenti
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
