Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl
Summary
Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d’ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2′-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l’aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.
Abstract
L’étude des petits ARN (ARN) par séquençage de la prochaine génération (NGS) est remise en question par des problèmes de partialité pendant la préparation de la bibliothèque. Plusieurs types d’ARNde tels que les microARN végétaux (miARN) portent une modification de 2′-O-méthyle (2′-OMe) à leur nucléotide terminal de 3′. Cette modification ajoute une autre difficulté car elle inhibe la ligature de l’adaptateur de 3′. Nous avons déjà démontré que les versions modifiées du protocole ‘TruSeq (TS)’ ont moins de biais et une meilleure détection des ARN 2′-OMe. Ici, nous décrivons en détail le protocole ‘TS5’, qui a montré la meilleure performance globale. TS5 peut être suivi soit à l’aide de réactifs faits maison ou de réactifs du kit TS, avec des performances égales.
Introduction
Les petits ARN (ARN) sont impliqués dans le contrôle d’une diversité de processus biologiques1. Les ARS réglementaires eucaryotes ont généralement entre 20 et 30 nt de taille; les trois principaux types sont les microARN (miRNA), les ARN piwi-interacting (piRNA) et les petits ARN interférant (siRNA). Les niveaux aberrants d’expression de miRNA ont été impliqués dans une série de maladies2. Cela souligne l’importance des miARN dans les domaines de la santé et des maladies et l’exigence d’outils de recherche précis et quantitatifs pour détecter les ARS en général.
Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est une méthode largement utilisée pour étudier les ARN. Principaux avantages de NGS par rapport à d’autres approches, telles que les techniques quantitatives PCR ou microarray (qPCR), sont qu’il n’a pas besoin d’une connaissance priori des séquences d’ARNs et peut donc être utilisé pour découvrir de nouvelles ARN, et en outre il souffre moins de signaux de fond et effets de saturation. En outre, il peut détecter les différences de nucléotide unique et a un débit plus élevé que les microréseaux. Cependant, NGS a également quelques inconvénients; le coût d’une exécution de séquençage reste relativement élevé et le processus en plusieurs étapes requis pour convertir un échantillon en bibliothèque pour le séquençage peut introduire des biais. Dans un processus typique de préparation de la bibliothèque sRNA, un adaptateur de 3′ est d’abord ligaté à l’ARNs (souvent gel-purifié à partir de l’ARN total) en utilisant une version tronquée de ligase d’ARN 2 (RNL2) et un adaptateur préadenyé 3 ‘ (Figure 1) en l’absence d’ATP. Cela augmente l’efficacité de la ligature sRNA-adaptateur et réduit la formation de réactions latérales telles que la circularisation de sRNA ou la concatemerization. Par la suite, un adaptateur de 5′ est ligated par la ligase 1 d’ARN (RNL1), suivi de la transcription inverse (RT) et de l’amplification de PCR. Toutes ces étapes peuvent introduire un biais3,4. Par conséquent, les nombres de lecture peuvent ne pas refléter les niveaux réels d’expression de l’ARNde conduisant à des modèles d’expression artificiels et dépendants de la méthode. Les ARS spécifiques peuvent être surreprésentées ou sous-représentées dans une bibliothèque, et les ARS fortement sous-représentés peuvent échapper à la détection. La situation est particulièrement compliquée avec les miARN végétaux, les siRNAs chez les insectes et les plantes, et les piARN chez les insectes, les nématodes et les mammifères, dans lesquels le nucléotide terminal de 3′ a une modification de 2′-O-méthyle (2′-OMe)1. Cette modification inhibe fortement la ligature adaptatrice de 3′5, ce qui rend la préparation de la bibliothèque pour ces types d’ARN une tâche difficile.
Les travaux antérieurs ont démontré que la ligature adaptateur introduit un biais sérieux, en raison de la séquence d’ARN / effets de structure6,7,8,9,10,11. Les étapes en aval de la ligature adaptateur tels que la transcription inversée et PCR ne contribuent pas de manière significative au biais6,11,12. Le biais de ligation est probablement dû au fait que les molécules adaptatrices avec une séquence donnée interagiront avec les molécules d’ARS dans le mélange de réaction pour former des co-plis, qui peuvent conduire à des configurations favorables ou défavorables pour la ligature (Figure 2). Les données de Sorefan etcoll. 7 suggèrent que RNL1 préfère un seul contexte échoué, tandis que RNL2 préfère un double brin pour la ligature. Le fait que les structures de co-pliage adaptateur/sRNA soient déterminées par l’adaptateur spécifique et les séquences sRNA explique pourquoi l’ARNs spécifique est surreprésenté ou sous-représenté avec un ensemble d’adaptateurs donné. Il est également important de noter que dans une série de bibliothèques sRNA à comparer, les mêmes séquences d’adaptateur doivent être utilisées. En effet, il a déjà été observé que le changement des adaptateurs par l’introduction de différentes séquences de codes à barres modifie les profils miRNA dans les bibliothèques de séquençage9,13.
La randomisation des séquences d’adaptateur près de la jonction de ligature réduit probablement ces biais. Sorefan et ses collègues7 ont utilisé des adaptateurs avec 4 nucléotides aléatoires à leurs extrémités, désignés adaptateurs « Haute Définition » (HD) et ont montré que l’utilisation de ces adaptateurs conduit à des bibliothèques qui reflètent mieux les niveaux d’expression de l’ARNs véritable. Des travaux plus récents ont confirmé ces observations et révélé que la région randomisée n’a pas besoin d’être adjacente à la jonction de ligature11. Ce nouveau type d’adaptateurs a été nommé “MidRand” adaptateurs. Ensemble, ces résultats démontrent qu’une meilleure conception de l’adaptateur peut réduire les biais.
Au lieu de modifier les adaptateurs, le biais peut être supprimé par l’optimisation des conditions de réaction. Polyéthylène glycol (PEG), un agent de crowding macromoléculaire connu pour augmenter l’efficacité de ligature14, a été montré pour réduire de manière significative le biais15,16. Sur la base de ces résultats, plusieurs kits « faible biais » sont apparus sur le marché. Il s’agit notamment de kits qui utilisent PEG dans les réactions de ligature, soit en combinaison avec des adaptateurs classiques ou adaptateurs HD. D’autres kits évitent la ligature tout à fait, et utilisent 3′ polyadenylation et la commutation de modèle pour 3′ et 5′ adaptateur d’ajout, respectivement12. Dans une autre stratégie, la ligature de l’adaptateur 3′ est suivie d’une étape de circularisation, omettant ainsi la ligation de l’adaptateur5′ 17.
Dans une étude précédente, nous avons cherché un protocole de préparation de bibliothèque d’ARND avec les niveaux les plus bas possibles de biais et la meilleure détection de 2′-OMe RNAs12. Nous avons testé quelques-uns des kits « faible biais » mentionnés ci-dessus, qui avaient une meilleure détection des ARN 2′-OMe que le protocole standard (TS). Étonnamment cependant, lors de la modification (l’utilisation d’adaptateurs randomisés, PEG dans les réactions de ligature et la suppression de l’excès 3′ adaptateur par purification) ce dernier a surpassé les autres protocoles pour la détection de 2′-OMe RNAs. Ici, nous décrivons en détail un protocole basé sur le protocole TS, ‘TS5′, qui avait la meilleure détection globale de 2’-OMe RNAs. Le protocole peut être suivi à l’aide de réactifs du kit TS et d’un réactif du kit ‘Nf’ ou, pour économiser de l’argent, en utilisant des réactifs faits maison, avec des performances égales. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la purification de l’ARNs à partir de l’ARN total et la préparation de l’adaptateur préadenyé de 3′.
Protocol
Representative Results
Discussion
La préparation de la petite bibliothèque d’ARN demeure difficile en raison du biais, principalement introduit pendant les étapes de ligature d’adaptateur. Les ARN avec une modification de 2′-OMe à leur extrémité de 3′ tels que les miARN de plante, le piRNA dans les insectes, les nématodes et les mammifères, et les petits ARN interférant (siRNA) dans les insectes et les usines sont particulièrement difficiles à étudier parce que la modification de 2′-OMe inhibe la ligature d’adaptateur de 3′ Un certain nombre …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le Centre national de la recherche scientifique (CNRS), la Commission Français des énergies alternatives et de l’énergie atomique (CEA) et l’Université Paris-Sud. Toutes les analyses de préparation de la bibliothèque, de séquençage de l’illumine et de bioinformatique pour cette étude ont été effectuées à l’installation de séquençage de nouvelle génération (NGS) de l’I2BC. Les membres de l’installation I2BC NGS sont reconnus pour la lecture critique du manuscrit et des suggestions utiles.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
Riferimenti
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