छोटे आरएनए-सेक में सुधार: कम पूर्वाग्रह और 2'-O-मिथाइल आरएनए की बेहतर जांच
Summary
हम मानक तरीकों की तुलना में कम पूर्वाग्रह और 2′-O-मिथाइल आरएनए के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता के साथ एक विस्तृत छोटे आरएनए पुस्तकालय मरम्मत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल लागत बचाने के लिए या सुविधा के लिए किट का उपयोग करने के लिए घर का बना अभिकर्मकों का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है.
Abstract
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) द्वारा छोटे आरएनए (एसआरए) के अध्ययन को पुस्तकालय की तैयारी के दौरान पूर्वाग्रह के मुद्दों द्वारा चुनौती दी जाती है। इस तरह के संयंत्र microRNAs (mirnAs) के रूप में sRNA के कई प्रकार के अपने 3′ टर्मिनल न्यूक्लिओटाइड पर एक 2′-O-मिथाइल (2′-OMe) संशोधन ले. यह संशोधन एक और कठिनाई कहते हैं के रूप में यह 3′ एडाप्टर ligation रोकता है. हम पहले से प्रदर्शित किया है कि संशोधित संस्करण ‘TruSeQ (टीएस) प्रोटोकॉल कम पूर्वाग्रह और 2’-OMe RNAs का एक बेहतर पता लगाने है. यहाँ हम विस्तार से प्रोटोकॉल ‘TS5’, जो सबसे अच्छा समग्र प्रदर्शन से पता चला में वर्णन. TS5 या तो घर का बना अभिकर्मकों या टीएस किट से अभिकर्मकों का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है, समान प्रदर्शन के साथ.
Introduction
छोटे RNAs (sRNAs) जैविक प्रक्रियाओं की विविधता के नियंत्रण में शामिल हैं1. यूकैरियोटिक नियामक sRNAs आम तौर पर 20 और 30 के बीच आकार में nt रहे हैं; तीन प्रमुख प्रकार microRNAs (miRNA), piwi-इंटरैक्टिंग RNAs (piRNA) और छोटे हस्तक्षेप RNAs (siRNA) हैं. एबरेन्ट मिरना अभिव्यक्ति स्तर को विभिन्न प्रकार के रोगों में फंसाया गया है2. यह स्वास्थ्य और रोग में miRNAs के महत्व और सामान्य रूप से SRNAs का पता लगाने के लिए सटीक, मात्रात्मक अनुसंधान उपकरणों के लिए आवश्यकता को रेखांकित करता है.
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) sRNAs का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। NGS के मुख्य लाभ के रूप में अन्य दृष्टिकोण के साथ तुलना में, इस तरह के मात्रात्मक पीसीआर या microarray तकनीक के रूप में (QPCR), कर रहे हैं कि यह sRNA दृश्यों की एक प्राथमिकता ज्ञान की जरूरत नहीं है और इसलिए उपन्यास RNAs की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इसके अलावा यह कम ग्रस्त है पृष्ठभूमि संकेत और संतृप्ति प्रभाव. इसके अलावा, यह एकल न्यूक्लिओटाइड मतभेदों का पता लगा सकता है और माइक्रोरेरेंस की तुलना में इसका थ्रूपुट अधिक होता है। हालांकि, एनजीएस में भी कुछ कमियां हैं; अनुक्रमण रन की लागत अपेक्षाकृत अधिक रहती है और अनुक्रमण के लिए एक नमूना को लायब्रेरी में परिवर्तित करने के लिए आवश्यक बहुचरण प्रक्रिया पूर्वाग्रहों को पेश कर सकती है। एक ठेठ SRNA पुस्तकालय की तैयारी की प्रक्रिया में, एक 3′ एडाप्टर पहले एसआरएनए के लिए ligated है (अक्सर कुल आरएनए से जेल शुद्ध) आरएनए लिगेज़ 2 (RNL2) और एक preadenylated 3′ एडाप्टर के एक छोटा संस्करण का उपयोग कर (चित्रा 1) एटीपी की अनुपस्थिति में. यह sRNA-एडाप्टर लिगेशन की दक्षता बढ़ जाती है और इस तरह के SNA परिपत्र या concatemerization के रूप में पक्ष प्रतिक्रियाओं के गठन को कम कर देता है। बाद में, एक 5′ एडाप्टर आरएनए लिगेस 1 (RNL1), रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) और पीसीआर प्रवर्धन के बाद द्वारा ligated है। इन सभी कदमों से पूर्वाग्रह3,4हो सकता है . नतीजतन, पढ़ने की संख्या कृत्रिम, विधि पर निर्भर अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए अग्रणी वास्तविक SRNA अभिव्यक्ति के स्तर को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है। विशिष्ट SRNAs या तो अधिक या किसी लायब्रेरी में underrepresented हो सकता है, और दृढ़ता से underrepresented SRNAs पता लगाने से बच सकते हैं. स्थिति विशेष रूप से पौधों miRNAs, कीड़ों और पौधों में siRNAs के साथ जटिल है, और कीड़ों, सूत्रकृमि और स्तनधारियों में piRNAs, जिसमें 3′ टर्मिनल न्यूक्लिओटाइड एक 2′-O-O-मेथिल (2′-OMe) संशोधन1है. इस संशोधन दृढ़ता से रोकता है 3′ एडाप्टर लिगेशन5, आरएनए के इन प्रकार के लिए पुस्तकालय की तैयारी एक मुश्किल काम कर रही है.
पिछले काम से पता चला है कि अनुकूलक लिगेशन गंभीर पूर्वाग्रह का परिचय देता है , आरएनए अनुक्रम/संरचना प्रभाव6,7,8,9,10,11के कारण . एडाप्टर लिगेशन के डाउनस्ट्रीम के कदम जैसे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर में पक्षपात नहीं होता6,11,12. लिगेशन बायस इस तथ्य के कारण संभव है कि किसी दिए गए अनुक्रम के साथ अनुकूलक अणु अभिक्रिया मिश्रण में एनआरएनए अणुओं के साथ सह-गुण बनाने के लिए सहभागिता करेंगे, जिससे या तो लिगेशन के लिए अनुकूल अथवा प्रतिकूल विन्यास हो सकता है (चित्र 2)। Sorefan एट अल7 से डेटा सुझाव है कि RNL1 एक भी फंसे संदर्भ पसंद करते हैं, जबकि RNL2 लिगेशन के लिए एक डबल किनारा पसंद करते हैं. तथ्य यह है कि एडाप्टर / SRNA सह गुना संरचनाओं विशिष्ट एडाप्टर द्वारा निर्धारित कर रहे हैं और sRNA अनुक्रम बताते हैं क्यों विशिष्ट sRNA पर कर रहे हैं – या एक दिए गए एडाप्टर सेट के साथ underrepresented. यह भी ध्यान दें कि SRNA पुस्तकालयों की एक श्रृंखला के भीतर तुलना की जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, एक ही एडाप्टर दृश्यों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. वास्तव में, यह पहले देखा गया है कि विभिन्न बारकोड दृश्यों की शुरूआत से एडाप्टर बदलने अनुक्रमण पुस्तकालयों9,13में miRNA प्रोफाइल बदल जाता है.
लिगेशन संधि के निकट अनुकूलक अनुक्रमों का यादृच्छिकीकरण इन पूर्वाग्रहों को कम कर देता है। Sorefan और उनके सहयोगियों7 उनके extremities पर 4 यादृच्छिक न्यूक्लिओटाइड के साथ एडाप्टर का इस्तेमाल किया, नामित “उच्च परिभाषा” (HD) एडाप्टर, और पता चला कि इन एडाप्टर का उपयोग पुस्तकालयों कि बेहतर सच SRNA अभिव्यक्ति के स्तर को प्रतिबिंबित करने के लिए नेतृत्व. हाल ही में किए गए कार्य ने इन प्रेक्षणों की पुष्टि की और यह प्रकट किया कि यादृच्छिकीकृत क्षेत्र को लिगेशन जंक्शन11से सटे होने की आवश्यकता नहीं है . एडाप्टर के इस उपन्यास प्रकार का नाम “MidRand” एडाप्टर था. साथ में, इन परिणामों को बेहतर एडाप्टर डिज़ाइन पूर्वाग्रह को कम कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है।
एडाप्टर को संशोधित करने के बजाय, पूर्वाग्रह प्रतिक्रिया शर्तों के अनुकूलन के माध्यम से दबा दिया जा सकता है। पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी), एक मैक्रोआण्विक भीड़ एजेंट जो लिगेशन दक्षता14में वृद्धि करने के लिए जाना जाता है , को पूर्वाग्रह15,16को काफी कम करने के लिए दिखाया गया है । इन परिणामों के आधार पर, कई “कम पूर्वाग्रह” किट बाजार पर दिखाई दिया. ये kits कि ligation प्रतिक्रियाओं में खूंटी का उपयोग, या तो शास्त्रीय एडाप्टर या HD एडाप्टर के साथ संयोजन में शामिल हैं. अन्य किट ligation पूरी तरह से बचने के लिए, और 3′ polyadenylation और टेम्पलेट का उपयोग करें 3′ और 5′ एडाप्टर इसके अलावा, क्रमशः12के लिए स्विचन. अभी तक एक और रणनीति में, 3′ एडाप्टर लिगेशन एक परिपत्रीकरण कदम के बाद है, इस प्रकार 5 ‘ एडाप्टर लिगेशन17omitting.
एक पिछले अध्ययन में, हम पूर्वाग्रह के सबसे कम संभव स्तर और का सबसे अच्छा पता लगाने के साथ एक SRNA पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल के लिए खोज की 2′-OMe RNAs12. हम मानक प्रोटोकॉल (टीएस) की तुलना में 2′-OMe RNAs का एक बेहतर पता लगाने था जो ऊपर उल्लिखित ‘कम पूर्वाग्रह’ किट, में से कुछ का परीक्षण किया. हैरानी की बात है कि हालांकि, संशोधन पर ( यादृच्छिक एडाप्टर का उपयोग, लिगेशन प्रतिक्रियाओं में खूंटी और शुद्धि द्वारा अतिरिक्त 3′ एडाप्टर को हटाने) बाद का पता लगाने के लिए अन्य प्रोटोकॉल outperformed 2′-OMe RNAs. यहाँ, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल TS प्रोटोकॉल पर आधारित वर्णन, ‘TS5′, जो का सबसे अच्छा समग्र पता लगाने था 2’-OMe RNAs. प्रोटोकॉल टीएस किट से अभिकर्मकों और ‘Nf’ किट से एक अभिकर्मक का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है या, पैसे बचाने के लिए, घर का बना अभिकर्मकों का उपयोग कर, समान प्रदर्शन के साथ. हम भी कुल आरएनए से SRNA के शुद्धिकरण और preadenylated 3′ एडाप्टर की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
छोटे आरएनए पुस्तकालय की तैयारी पूर्वाग्रह के कारण चुनौतीपूर्ण बनी हुई है, मुख्य रूप से एडाप्टर लिगिंग चरणों के दौरान शुरू की गई। उनके 3 के अंत में एक 2′-OMe संशोधन के साथ RNAs इस तरह के संयंत्र mirna, कीड़े में piRNA, स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय केंद्र (CNRS), फ्रेंच वैकल्पिक ऊर्जा और परमाणु ऊर्जा आयोग (सीईए) और पेरिस-सूड विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था. इस अध्ययन के लिए सभी पुस्तकालय तैयारी, Illumina अनुक्रमण और bioinformaticविश्लेषण विश्लेषण I2BC अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) सुविधा में प्रदर्शन किया गया. I2BC NGS सुविधा के सदस्यों पांडुलिपि और उपयोगी सुझावों के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्वीकार कर रहे हैं.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
Riferimenti
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