Forbedre små RNA-SEQ: mindre bias og bedre påvisning av 2 '-O-metyl RNAs
Summary
Vi presenterer en detaljert liten RNA bibliotek oppreisning protokoll med mindre bias enn standard metoder og en økt følsomhet for 2 ‘-O-methyl RNAs. Denne protokollen kan følges ved hjelp av hjemmelagde reagenser for å spare kostnader eller bruke kits for enkelhets skyld.
Abstract
Studiet av små RNAs (sRNAs) av neste generasjons sekvensering (NGS) er utfordret av bias problemer under biblioteket forberedelse. Adskillige typer av sRNA som plante microRNAs (miRNAs) befordre en 2 ‘-O-methyl (2 ‘-OMe) modifisering på deres 3 ‘ Terminal nukleotid. Denne endringen legger til en annen vanskelighet som hemmer 3 ‘ adapter ligation. Vi har tidligere demonstrert at modifiserte versjoner av ‘ TruSeq (TS) ‘ protokoll har mindre bias og en forbedret påvisning av 2 ‘-OMe RNAs. Her beskriver vi i detalj protokollen ‘ TS5 ‘, som viste den beste samlede ytelsen. TS5 kan følges enten med hjemmelagde reagenser eller reagenser fra TS-settet, med samme ytelse.
Introduction
Små RNAs (sRNAs) er involvert i kontroll av et mangfold av biologiske prosesser1. Eukaryote regulatoriske sRNAs er vanligvis mellom 20 og 30 NT i størrelse; de tre hovedtyper er microRNAs (miRNA), piwi-interaksjon RNAs (piRNA) og små forstyrrende RNAs (siRNA). Avvikende miRNA uttrykks nivåer har vært innblandet i en rekke sykdommer2. Dette understreker viktigheten av miRNAs i helse og sykdom og kravet om nøyaktig, kvantitativ forskning verktøy for å oppdage sRNAs generelt.
Neste generasjons sekvensering (NGS) er en mye brukt metode for å studere sRNAs. Hovedfordelene med NGS sammenlignet med andre tilnærminger, slik som kvantitativ PCR eller Microarray teknikker (qPCR), er at den ikke trenger a priori kjennskap til sRNA sekvenser og kan derfor brukes til å oppdage romanen RNAs, og i tillegg lider det mindre av bakgrunns signal og metning effekter. Videre, den kanne merker enkelt nukleotid forskjellene og har en høyere produksjon enn Microarrays. Men NGS har også noen ulemper; kostnaden for en sekvensering kjøre fortsatt relativt høy og flertrinnsprosessen som kreves for å konvertere et eksempel til et bibliotek for sekvensering kan innføre skjevheter. I en typisk sRNA bibliotek Forberedelses prosess, en 3 ‘ adapter er først ligaturer til sRNA (ofte gel-renset fra total RNA) ved hjelp av en avkortet versjon av RNA ligase 2 (RNL2) og en preadenylated 3 ‘ adapter (figur 1) i fravær av ATP. Dette øker effektiviteten til sRNA-adapter-ligation og reduserer dannelsen av side reaksjoner som sRNA circularization eller concatemerization. Deretter blir en 5-adapter ligaturer av RNA ligase 1 (RNL1), etterfulgt av omvendt transkripsjon (RT) og PCR forsterkning. Alle disse trinnene kan innføre bias3,4. Derfor kan ikke lese tall gjenspeile faktiske sRNA uttrykks nivåer som fører til kunstige, metode avhengige uttrykks mønstre. Spesifikke sRNAs kan være enten over-eller underrepresentert i et bibliotek, og sterkt underrepresentert sRNAs kan unnslippe deteksjon. Situasjonen er spesielt komplisert med anlegget miRNAs, siRNAs i insekter og planter, og piRNAs i insekter, nematoder og pattedyr, der 3 ‘ Terminal nukleotid har en 2 ‘-O-metyl (2 ‘-OMe) modifikasjon1. Denne endringen hemmer sterkt 3 ‘ adapter ligation5, noe som gjør biblioteket forberedelse for disse typer RNA en vanskelig oppgave.
Tidligere arbeid demonstrerte at adapter ligation introduserer alvorlige bias, på grunn av RNA sekvens/struktur effekter6,7,8,9,10,11. Trinn nedstrøms for adapter ligation som omvendt transkripsjon og PCR ikke signifikant bidra til bias6,11,12. Ligation bias er sannsynligvis på grunn av det faktum at adapter molekyler med en gitt sekvens vil samhandle med sRNA molekyler i reaksjonsblandingen å danne co-folder, som kan enten føre til gunstige eller ugunstige konfigurasjoner for ligation (figur 2). Data fra Sorefan et al7 tyder på at RNL1 foretrekker en enkelt strandet sammenheng, mens RNL2 foretrekker en dobbel tråd for ligation. Det faktum at adapter/sRNA co-fold strukturer bestemmes av bestemte kortet og sRNA sekvenser forklarer hvorfor bestemte sRNA er over-eller underrepresentert med et gitt adaptersett. Det er også viktig å merke seg at innenfor en serie sRNA biblioteker som skal sammenlignes, bør de samme adapter sekvensene brukes. Faktisk har det tidligere blitt observert at skiftende adaptere ved innføringen av ulike strekkode sekvenser endrer miRNA profiler i sekvensering biblioteker9,13.
Tilfeldiggjøring av kort sekvenser i nærheten av ligation knutepunkt reduserer sannsynligvis disse skjevheter. Sorefan og kolleger7 brukte adaptere med 4 tilfeldige nukleotider på sine ekstremiteter, utpekt “High Definition” (HD) adaptere, og viste at bruken av disse kortene føre til biblioteker som bedre reflekterer sanne sRNA uttrykks nivåer. Nyere arbeid bekreftet disse observasjonene og avslørte at den randomiserte regionen ikke trenger å være ved siden av ligation Junction11. Denne romanen type adaptere ble kalt “MidRand” adaptere. Sammen viser disse resultatene at forbedret adapter design kan redusere bias.
I stedet for å endre kortene, kan bias undertrykkes gjennom optimalisering av reaksjonsbetingelser. Polyetylen glykol (PEG), en makro molekylære trengsel agent kjent for å øke ligation effektivitet14, har vist å redusere bias15,16. Basert på disse resultatene, flere “lav bias” kits dukket opp på markedet. Disse inkluderer kits som bruker PEG i ligation reaksjoner, enten i kombinasjon med klassiske adaptere eller HD-adaptere. Andre kits unngå ligation helt, og bruke 3 ‘ polyadenylation og mal bytte for 3 ‘ og 5 ‘ adapter tillegg, henholdsvis12. I enda en strategi, 3 ‘ adapter ligation etterfølges av en circularization trinn, og dermed Utelat 5 ‘ adapter ligation17.
I en tidligere studie, søkte vi etter en sRNA bibliotek forberedelse protokoll med lavest mulige nivåer av bias og den beste oppdagelsen av 2 ‘-OMe RNAs12. Vi testet noen av de ovenfor nevnte “lav bias” kits, som hadde en bedre oppdagelse av 2 ‘-OMe RNAs enn standardprotokollen (TS). Overraskende imidlertid, ved modifisering (bruk av randomiserte adaptere, PEG i ligation reaksjoner og fjerning av overflødig 3 ‘ adapter ved rensing) sistnevnte bedre resultater enn de andre protokollene for påvisning av 2 ‘-OMe RNAs. Her beskriver vi i detalj en protokoll basert på TS protokollen, ‘ TS5 ‘, som hadde den beste generelle oppdagelsen av 2 ‘-OMe RNAs. Protokollen kan følges ved hjelp av reagenser fra TS-settet og én reagens fra “NF”-settet, eller for å spare penger ved å bruke hjemmelagde reagenser, med lik ytelse. Vi gir også en detaljert protokoll for rensing av sRNA fra total RNA og utarbeidelse av preadenylated 3 ‘ adapter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Liten RNA biblioteket forberedelse er fortsatt utfordrende på grunn av bias, hovedsakelig innført under adapter ligation trinn. RNAs med en 2 ‘-OMe modifikasjon på deres 3 ‘ end som plante miRNAs, piRNA i insekter, nematoder og pattedyr, og små forstyrrende RNAs (siRNA) i insekter og planter er spesielt vanskelig å studere fordi 2 ‘-OMe modifikasjon hemmer 3 ‘ adapter ligation. En rekke løsninger har blitt foreslått i litteraturen for å forbedre sRNA bibliotek forberedelse protokoller, men de fleste kommersielt t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Center for Scientific Research (CNRS), den franske alternative energier og Atomic Energy Commission (CEA) og Paris-Sud University. Alle bibliotek forberedelse, Illumina sekvensering og bioinformatikk analyser for denne studien ble utført på I2BC neste generasjons sekvensering (NGS) anlegget. Medlemmene av I2BC NGS-anlegget er anerkjent for kritisk lesning av manuskriptet og nyttige forslag.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
Riferimenti
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
