Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs
Summary
Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 ‘-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.
Abstract
O estudo de pequenas RNAs (sRNAs) por sequenciamento de próxima geração (NGS) é desafiado por problemas de viés durante a preparação da biblioteca. Diversos tipos de sRNA tais como microRNAs da planta (miRNAs) carregam uma modificação 2 ‘-O-methyl (2 ‘-OMe) em seus 3 ‘ nucleotide terminal. Esta modificação acrescenta outra dificuldade, pois inibe 3 ‘ ligadura do adaptador. Nós demonstramos previamente que as versões modificadas do protocolo de TruSeq (TS) têm menos polarização e uma deteção melhorada de 2 ‘-OMe RNAs. Aqui nós descrevemos no protocolo do detalhe ‘ TS5 ‘, que mostrou o melhor desempenho total. TS5 pode ser seguido usando reagentes caseiros ou reagentes do kit TS, com desempenho igual.
Introduction
Pequenas RNAs (sRNAs) estão envolvidas no controle de uma diversidade de processos biológicos1. Os sRNAs regulatórios eucarióticos são tipicamente entre 20 e 30 NT de tamanho; os três tipos principais são microRNAs (miRNA), Piwi-interagindo RNAs (piRNA) e RNAs de interferência pequenas (siRNA). Os níveis de expressão de miRNA aberrantes têm sido implicados em uma variedade de doenças2. Isso ressalta a importância do miRNAs na saúde e na doença e a exigência de ferramentas de pesquisa quantitativas e precisas para detectar sRNAs em geral.
O sequenciamento de próxima geração (NGS) é um método amplamente utilizado para estudar sRNAs. As vantagens principais de NGS em comparação com outras aproximações, tais como técnicas quantitativas do PCR ou do microarray (qPCR), são que não precisa um conhecimento a priori das seqüências de sRNA e podem conseqüentemente ser usadas para descobrir RNAs novas, e além sofre menos de sinal de fundo e efeitos de saturação. Além disso, ele pode detectar diferenças de nucleotídeo único e tem uma taxa de transferência maior do que Microarrays. No entanto, o NGS também tem algumas desvantagens; o custo de uma execução de seqüenciamento permanece relativamente alto e o processo de várias etapas necessário para converter uma amostra em uma biblioteca para seqüenciamento pode introduzir vieses. Em um processo típico de preparação da biblioteca sRNA, um adaptador de 3 ‘ é primeiro ligado ao sRNA (muitas vezes purificado a partir do RNA total) usando uma versão truncada de RNA ligase 2 (RNL2) e um adaptador de 3 ‘ preadenylated (Figura 1) na ausência de ATP. Isso aumenta a eficiência da ligadura do adaptador sRNA e reduz a formação de reações colaterais, como circularização de sRNA ou concatemerização. Posteriormente, um adaptador de 5 ‘ é ligado por RNA ligase 1 (RNL1), seguido por transcrição reversa (RT) e amplificação de PCR. Todos estes passos podem introduzir viés3,4. Consequentemente, os números de leitura podem não refletir os níveis de expressão sRNA reais, levando a padrões de expressão artificiais e dependentes de método. Os sRNAs específicos podem ser over-ou underrepresentado em uma biblioteca, e os sRNAs fortemente subrepresentados podem escapar da detecção. A situação é particularmente complicada com miRNAs vegetais, siRNAs em insetos e plantas, e piRNAs em insetos, nematoides e mamíferos, nos quais o nucleotídeo terminal 3 ‘ tem uma modificação 2 ‘-O-metil (2 ‘-OMe)1. Esta modificação inibe fortemente 3 ‘ ligadura do adaptador5, fazendo a preparação da biblioteca para estes tipos de RNA uma tarefa difícil.
O trabalho prévio demonstrou que a ligadura do adaptador introduz viés grave, devido àsequência de RNA/efeitos de estrutura6,7,8,9,10,11. As etapas a jusante da ligadura do adaptador tais como a transcrição reversa e o PCR não contribuem significativamente à polarização6,11,12. A polarização da ligadura é provável devido ao fato de que as moléculas do adaptador com uma determinada seqüência irão interagir com moléculas de sRNA na mistura de reação para formar codobras, que podem levar a configurações favoráveis ou desfavoráveis para a ligadura (Figura 2). Dados de Sorefan et al7 SUGEREM que RNL1 prefere um único contexto encalhado, enquanto RNL2 prefere uma dupla vertente para a ligadura. O fato de que as estruturas cofold Adapter/sRNA são determinadas pelo adaptador específico e seqüências sRNA explica por que sRNA específicos são over-ou underrepresentado com um determinado adaptador definido. Também é importante notar que, dentro de uma série de bibliotecas sRNA a serem comparadas, as mesmas sequências de adaptadores devem ser usadas. De fato, tem sido observado anteriormente que a mudança de adaptadores pela introdução de diferentes sequências de código de barras altera os perfis de Mirna nas bibliotecas de sequenciamento9,13.
A randomização de seqüências de adaptadores perto da junção de ligadura provavelmente reduz esses desvios. Sorefan e colegas7 adaptadores usados com 4 nucleotídeos aleatórios em suas extremidades, designados adaptadores de “alta definição” (HD), e mostraram que o uso desses adaptadores levam a bibliotecas que refletem melhor os níveis de expressão de Srna verdadeiros. O trabalho mais recente confirmou essas observações e revelou que a região randomizada não precisa ser adjacente à junção de ligadura11. Este novo tipo de adaptadores foi nomeado “MidRand” adaptadores. Juntos, esses resultados demonstram que o design aprimorado do adaptador pode reduzir o viés.
Em vez de modificar os adaptadores, o viés pode ser suprimido através da otimização das condições de reação. O polietileno glicol (PEG), um agente de aglomeração macromolecular conhecido para aumentar a eficiência da ligadura14, foi mostrado para reduzir significativamente o viés15,16. Com base nesses resultados, vários kits de “baixo viés” apareceram no mercado. Estes incluem kits que utilizam PEG nas reacções de ligadura, quer em combinação com adaptadores clássicos ou adaptadores HD. Outros kits de evitar a ligadura completamente, e usar 3 ‘ poliadenilação e modelo de comutação para 3 ‘ e 5 ‘ adaptador de adição, respectivamente12. Em outra estratégia, 3 ‘ ligadura do adaptador é seguido por uma etapa de circularização, omitindo assim 5 ‘ ligadura do adaptador17.
Em um estudo anterior, procurou-se um protocolo de preparação da biblioteca sRNA com os menores níveis possíveis de viés e a melhor detecção de 2 ‘-OMe RNAs12. Nós testamos alguns dos acima mencionados ‘ baixo viés ‘ kits, que teve uma melhor detecção de 2 ‘-OMe RNAs do que o protocolo padrão (TS). Surpreendentemente, no entanto, após a modificação (o uso de adaptadores randomizados, PEG nas reações de ligadura e remoção do excesso de 3 ‘ adaptador por purificação) o último superou os outros protocolos para a detecção de 2 ‘-OMe RNAs. Aqui, descrevemos detalhadamente um protocolo baseado no protocolo TS, ‘ TS5 ‘, que teve a melhor detecção geral de RNAs 2 ‘-OMe. O protocolo pode ser seguido usando reagentes do kit TS e um reagente do kit ‘ NF ‘ ou, para economizar dinheiro, usando reagentes caseiros, com igual desempenho. Nós igualmente fornecemos um protocolo detalhado para a purificação de sRNA do RNA total e a preparação de 3 ‘ adaptador preadenylated.
Protocol
Representative Results
Discussion
A preparação pequena da biblioteca do RNA permanece desafiante devido ao viés, introduzida principalmente durante etapas da ligadura do adaptador. RNAs com uma modificação de 2 ‘-ome em sua extremidade 3 ‘ tal como miRNAs da planta, Pirna nos insetos, nematóides e mamíferos, e RNAs de interferência pequenos (siRNA) nos insetos e nas plantas são particularmente difíceis de estudar porque a modificação 2 ‘-ome inibe 3 ‘ a ligadura do adaptador. Uma série de soluções foram propostas na literatura para melhora…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de pesquisa científica (CNRS), as energias alternativas francesas e a Comissão de energia atômica (CEA) e a Universidade Paris-Sud. Toda a preparação da biblioteca, o sequenciamento de Illumina e as análises de Bioinformática para este estudo foram realizadas na instalação de sequenciamento da próxima geração do I2BC (NGS). Os membros da instalação do I2BC NGS são reconhecidos para a leitura crítica do manuscrito e sugestões úteis.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
Riferimenti
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