小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善
Summary
我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2′-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。
Abstract
次世代シーケンシング(NGS)による小型RNA(sRNA)の研究は、図書館準備中のバイアス問題に挑戦しています。植物マイクロRNA(miRNA)のようないくつかのタイプのsRNAは、3’末端ヌクレオチドで2′-O-メチル(2′-OMe)修飾を運ぶ。この変更は、3′ アダプターのライゲーションを阻害するので、別の難しさを追加します。以前に、’TruSeq(TS)プロトコルの変更バージョンはバイアスが少なく、2′-OMe RNAの検出が改善されたことを実証しました。ここでは、最高の全体的なパフォーマンスを示したプロトコル’TS5’を詳細に説明します。TS5は、同等の性能を持つTSキットの自家製試薬または試薬を使用して従うことができます。
Introduction
小さなRNA(sRNA)は、生物学的プロセス1の多様性の制御に関与している。真核生物調節sRNAは、通常、サイズが20〜30 ntの間です。主な3つのタイプは、マイクロRNA(miRNA)、ピウィ相互作用RNA(piRNA)、小干渉RNA(siRNA)です。異常なmiRNA発現レベルは、様々な疾患2に関与している。これは、健康と病気におけるmiRNAの重要性と、sRNA全般を検出するための正確で定量的な研究ツールの要件を強調しています。
次世代シーケンシング(NGS)は、sRNAを研究するために広く使用されている方法です。定量的PCRやマイクロアレイ技術(qPCR)などの他のアプローチと比較したNGSの主な利点は、sRNA配列の事前知識を必要としないため、新しいRNAを発見するために使用できることであり、さらに、より少ないバックグラウンド信号と彩度効果。さらに、単一ヌクレオチドの違いを検出でき、マイクロアレイよりも高いスループットを有する。ただし、NGS にはいくつかの欠点もあります。シーケンス実行のコストは比較的高く、サンプルをシーケンス用ライブラリに変換するために必要なマルチステップ プロセスによってバイアスが発生する可能性があります。典型的なsRNAライブラリー調製プロセスでは、3’アダプターは、ATPが存在しない場合に、RNAリガーゼ2(RNL2)の切り捨てられたバージョンと予備の3’アダプター(図1)を使用してsRNA(多くの場合、全RNAからゲル精製)にライゲーションされます。これにより、sRNAアダプタライゲーションの効率が向上し、sRNAの循環化や連結などの副反応の形成が減少します。続いて、5’アダプターをRNAリガーゼ1(RNL1)によってライゲーションし、続いて逆転転写(RT)およびPCR増幅を行う。これらのステップはすべて、バイアス3,4を導入する可能性があります。したがって、読み取り数は、人工的な、方法依存性発現パターンにつながる実際のsRNA発現レベルを反映しない場合があります。特定の sRNA は、ライブラリ内で過剰または過小表現され、厳密に表現されていない sRNA が検出を逃れる可能性があります。この状況は、特に植物miRNA、昆虫および植物のsiRNA、および昆虫、線虫および哺乳動物におけるpiRNAで、3’末端ヌクレオチドが2′-O-メチル(2′-OMe)修飾1を有する。この修飾は、3’アダプタライゲーション5を強く阻害し、これらのタイプのRNAに対するライブラリー調製を困難な作業にする。
以前の研究は、アダプタライゲーションがRNA配列/構造効果6、7、8、9、10、11に起因する深刻なバイアスを導入することを実証しました。逆転写やPCRなどのアダプタライゲーションの下流のステップは、バイアス6、11、12に有意に寄与しない。ライゲーションバイアスは、特定の配列を有するアダプタ分子が反応混合物中のsRNA分子と相互作用して共折を形成し、ライゲーションに有利または好ましくない構成を引き起こす可能性があるという事実に起因する可能性が高い(図2)。Sorefan et al7のデータは、RNL1 が単一の孤立したコンテキストを好む一方、RNL2 がライゲーション用の二本鎖を好むことを示唆しています。アダプター/sRNA 共折構造が特定のアダプターと sRNA シーケンスによって決定されるという事実は、特定の sRNA が特定のアダプター・セットで過剰または過小表現される理由を説明します。また、一連の sRNA ライブラリー内で比較する場合は、同じアダプタシーケンスを使用する必要があることも重要です。実際、異なるバーコードシーケンスの導入によってアダプタを変更すると、シーケンスライブラリ9、13のmiRNAプロファイルが変更されることが以前に観察されています。
ライゲーションジャンクション付近のアダプタシーケンスのランダム化は、これらのバイアスを減らす可能性が高いです。Sorefanたちは、4つのランダムなヌクレオチドを持つアダプターを四肢に使用し、「高精細」(HD)アダプターと指定し、これらのアダプターを使用すると、真のsRNA発現レベルをよりよく反映するライブラリにつながることを示した。より最近の研究は、これらの観察を確認し、無作為化領域がライゲーション接合部11に隣接する必要がならないことを明らかにした。この新しいタイプのアダプターは”MidRand”アダプターと名付けられました。これらの結果を組み合わせることで、アダプターの設計が改善され、バイアスが軽減される可能性が示されています。
アダプターを変更する代わりに、反応条件の最適化によってバイアスを抑制できます。ポリエチレングリコール(PEG)は、ライゲーション効率14を高くすることが知られている高分子群集剤であり、バイアス15、16を有意に減少させることが示されている。これらの結果に基づいて、いくつかの「低バイアス」キットが市場に登場しました。これには、古典的なアダプターまたは HD アダプターと組み合わせて、ライゲーション反応に PEG を使用するキットが含まれます。他のキットは、ライゲーションを完全に回避し、それぞれ12′と5’アダプタの追加のための3’ポリアデニル化とテンプレート切り替えを使用します。さらに別の戦略では、3′ アダプターライゲーションに続いて循環ステップが続き、5′ アダプターライゲーション17を省略します。
前回の研究では、バイアスの可能な限り低いレベルと2′-OMe RNA12の最良の検出を持つsRNAライブラリー調製プロトコルを検索しました。上記の「低バイアス」キットのいくつかをテストし、標準プロトコル(TS)よりも2′-OMe RNAの検出が優れています。しかし、驚くべきことに、修正時(無作為化アダプターの使用、ライゲーション反応におけるPEG、精製による余分な3’アダプタの除去)は、後者が2′-OMe RNAの検出のための他のプロトコルを上回った。ここでは、2′-OMe RNA の全体的な検出が最も優れた TS プロトコル ‘TS5’ に基づくプロトコルについて詳しく説明します。プロトコルは、TSキットの試薬と’Nf’キットの試薬1つを使用して、または同等の性能を持つ自家製試薬を使用して、お金を節約することができます。また、総RNAからのsRNAの精製と、3’アダプターの準備のための詳細なプロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
小さなRNAライブラリーの準備は、主にアダプタライゲーションステップ中に導入されるバイアスのために困難なままです。植物miRNA、昆虫、線虫および哺乳類のpiRNA、昆虫および植物における小さな干渉RNA(siRNA)のような3’末端に2′-OMe修飾を伴うRNAは、2′-OMe修飾が3’アダプターリゲーションを阻害するので、特に研究が困難である。sRNAライブラリー調製プロトコルを改善するために多くの解決策…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学研究センター(CNRS)、フランス代替エネルギー・原子力委員会(CEA)、パリ・スード大学によって支援されました。本研究のための全ての図書館準備、イルミナシーケンシングおよびバイオインフォマティクス分析は、I2BC次世代シーケンシング(NGS)施設で行われました。I2BC NGS施設のメンバーは、原稿の批判的な読み取りと有用な提案のために認められている。
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
Riferimenti
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
