Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme
Summary
Antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu bir konjuge gelişimi zararlı antikorların ortadan kaldırılması için yeni bir yeniliktir. Burada, Dang virüsü enfeksiyonu sırasında antikorbağımlı geliştirme etkisini ortadan kaldırmak için seçici olarak 4G2 antikor engelleyebilir DCAF1 molekülünün sentezi için ayrıntılı bir protokol açıklar.
Abstract
Zararlı antikorların organizmalardan uzaklaşması, Dang hemorajik ateş ve otoimmün hastalıklar gibi antikorilişkili hastalıkların müdahalesi için değerli bir yaklaşımdır. Farklı epitopslara sahip binlerce antikor kanda dolaştığından, antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu konjuge dışında evrensel bir yöntemin spesifik zararlı antikorları hedef ettiği bildirilmiştir. DCAF moleküllerinin gelişimi, dang virüsü (DENV) enfeksiyon modelinde antikor bağımlı geliştirme (ADE) etkisini ortadan kaldırmak ve asetilkolinartırmak için gösterilmiştir hedefli tedavi, ilerlemesine önemli katkı yapar bir miyastenia gravis modelinde reseptör aktivitesi. Burada, Dang virüs enfeksiyonu sırasında ADE etkisini zayıflatmak için 4G2 antikorunu seçici olarak bloke eden ve DCAF1 ile 4G2 antikorunun ELISA testi ile bağlanmasını gösteren bir DCAF molekülünün (DCAF1) sentezine yönelik bir protokolü tanımlıyoruz. Yöntemimizde DCAF1, fc-III peptidin hidrat türevinin konjugasyonu ve doğal kimyasal ligasyon (NCL) yoluyla antijenik diziliuzun uzun α-sarlis ifade edilmesi yle sentezlenir. Bu protokol, cognate antikorlarını hedeflemek için DCAF1’e ve diğer DCAF moleküllerine başarıyla uygulanmıştır.
Introduction
Antikorlar patojenik bakteri ve virüslerin nötralizasyonu için humoral immün yanıt önemli rol oynamaktadır1. Ancak, bazı antikorlar organizmalar için zararlı etkiler sergiler, DENV enfeksiyonu sırasında ADE etkisi çapraz reaktif antikorlar ve miyasteni ait gravis aşırı reaktif antikorlar gibi, hangi bir otoimmünhastalıklar2,3. ADE etkisi DENV ve Fc reseptör sunan hücreleri bağlamak için köprü yapmak çapraz reaktif antikorlar aracılık edilir4,5, miyasteni gravis asetilkolin reseptörlerine saldıran aşırı antikorlar neden olurken kas dokusunda hücre-hücre kavşakları arasında6,7. Bu hastalıkların tedavisinde kısmen etkili yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen8,9, şüphesiz bu zararlı antikorların doğrudan ortadan kaldırılması müdahaleler için ilerleme olacaktır.
Son zamanlarda, çift fonksiyonlu gruplara sahip DCAF molekülleri, hedefli antikor blokaj ı için geliştirilmiştir10. DCAF 3 bölümden oluşan uzun bir peptittir: 1) spesifik bir antijen parçası cognate antikor tanıyabilir, 2) fc-III veya Fc-III-4C etiketi güçlü antikor Fc bölgesine bağlı ya Fc reseptör veya kompleman bileşen proteinleri inhibe etmek için , 3) bu iki fonksiyonel grup10conjugates uzun bir α-sarmal bağlayıcı . Moesin FERM etki alanından tasarlanan bağlantı parçası, Bir DCAF molekülündeki antijen ve Fc-III kısmının aynı anda IgG’nin Fab ve Fc bölgelerine bağlanabilmesini sağlamak için Rosseta yazılımı tarafından optimize edildi. Dört DCAF molekülleri hedef 4 farklı antikorlar için sentezlenmiş, aralarında DCAF1 4G2 antikor ortadan kaldırmak için kullanılmıştır, Hangi DENV enfeksiyonu sırasında çapraz reaktif antikor ADE etkisine katkıda bulunmak için; ve DACF4 miyasteni ait gravis10mab35 antikor engelleyerek asetilkolin reseptörlerinin kurtarılması için tasarlanmıştır.
Örnek olarak DCAF1’i örnek alan bu çalışmada, DCAF molekülünün sentezi ve DCAF ve bilişli antikor arasındaki etkileşimin saptanması için protokolleri gösterdik. DCAF1 ncl yaklaşım11,12,13,14, bir Fc-III peptid hidrat türevi ve ifade bağlayıcı-antijen parçaları birlikte conjugates tarafından yarı sentezlenir. Her iki yöntem de düşük verim ve yüksek maliyetyol çünkü NCL yaklaşımı, tam kimyasal sentezve DCAF1 sentezi için tam rekombinant ifade üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Mevcut yaklaşım sadece tam uzunlukta DCAF almak için en uygun maliyetli bir yoldur, ama aynı zamanda yerel formu olarak benzer bağlayıcı parçasının konformasyon koruyabilirsiniz. Farklı DCAF molekülleri antijen parçaları dışında benzer dizilere sahip olduğundan, DCAF1 sentezi ve DCAF1 ve 4G2 antikorları arasındaki etkileşim telimizden dolayı yöntemlerimiz diğer DCAF moleküllerine uygulanabilir ve bu moleküllerin biliş antikorlarını bloke etmek hedeflenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Buradaki protokol, Şekil 1’degösterilen NCL yaklaşımı kullanılarak DCAF1’in yarı sentezini ve saptanması açıklanmaktadır. Kısaca, DCAF1’in iki parçası sırasıyla kimyasal sentezlenir ve yeniden ifade edilir; sonra, tam uzunlukta DCAF1 molekülü monte edilir, modifiye ve saflaştırılır. Hydrazine türetilen Fc-III parça sentezi için, düşük kapasiteli 2-Cl reçine kullanımı oldukça önemlidir, çünkü yüksek kapasiteli hidrazin üretimi için olumsuz bir etkiye sah…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Tsinghua Üniversitesi-Gates Vakfı (hayır. OPP1021992), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (no. 21502103, 21877068 ve 041301475) ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (no. 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
Riferimenti
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
