Очистка человека S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток
Summary
Этот протокол описывает метод очистки для рекомбинантных тегов без кальция связывающий белок S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для человека моноцитов стимуляции анализов.
Abstract
В этом протоколе мы описываем метод очистки человека кальций-связывающий белок S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров из культуры escherichia coli для стимуляции иммунных клеток. Этот протокол основан на двухступенчатой стратегии хроматографии, которая включает в себя предочищение белка на колонке хроматографии анион-обменификации и последующий полировка шага на колонке гидрофобного взаимодействия. Эта стратегия производит белок S100A12 высокой чистоты и урожайности при управляемых затратах. Для функциональных анализов на иммунных клетках возможное пережитеевое эндотоксинное загрязнение требует тщательного мониторинга и дальнейших мер по очистке для получения белка без эндотоксина. Большинство эндотоксинных загрязнений могут быть исключены с помощью анион-обменной хроматографии. Для истощения остаточного загрязнения в этом протоколе описывается шаг удаления центробежных фильтров. В зависимости от доступных ионно-силовых S100A12 может организовать в различных homomultimers. Для изучения взаимосвязи между структурой и функцией, этот протокол далее описывает ионную обработку белка S100A12 с последующим химическим перекрестным соединением для стабилизации олигомеров S100A12 и их последующего разделения путем исключения размера Хроматографии. Наконец, мы описываем анализ на основе клеток, который подтверждает биологическую активность очищенного белка и подтверждает препарат без LPS.
Introduction
S100A12 является кальциевый связывающий белок, который в основном производится человеческими гранулоцитами. Белок переэкспрессирован во время (системного) воспаления и его уровня сыворотки, особенно при (авто) воспалительных заболеваниях, таких как системный ювенильный идиопатический артрит (sJIA), семейная средиземноморская лихорадка (FMF) или болезнь Кавасаки (KD) может сообщить о активности заболевания и реакции на терапию. В зависимости от рецепторов распознавания образов (PRRs), таких как платные рецепторы (TLRs), врожденная иммунная система может быть активирована патогенно-ассоциированными молекулярными моделями (PAMP), такими как липополисахариды (LPS) или повреждения, связанные с молекулярными моделями (DAMPs; также называют «аларминами»). DAMPs являются эндогенные молекулы, такие как клеточные белки, липиды или нуклеиновые кислоты1. DAMP-функции хорошо описаны для членов семейства белка кальгранулин, S100A8/A9 и S100A122, которые также, как сообщается, работают как divalent металл ион-chelating антимикробных пептидов3,4, 5,6. В зависимости от имеющейся ионной силы S100A12 может, как и другие члены семейства S100, организовать в различных homomultimers и до недавнего времени влияние S100A12-олигомеризации на PRR-взаимодействия, в частности TLR4, было неизвестно.
Мономерная форма белка (92 аминокислоты, 10,2 кДа) состоит из двух структур сгелиса-петли-селикса EF, соединенных гибким связующим звеном. C-терминальныйEF-hand содержит классический мотив Ca 2′-связывающий, в то время как N-терминальныйEF-hand демонстрирует структуру расширенной петли S100 («псевдо-EF-hand») и показывает уменьшенную Ca2′-сродство. Ca 2 “-связывание S100A12 может вызвать серьезные конформационные изменения в C-терминубелков, что приводит к воздействию гидрофобного патча на каждом мономере и образует димеризации интерфейса. Таким образом, в физиологических условиях наименьшая четырехкратная структура, образованная S100A12, является нековалентным dimer (примерно 21 kDa), в котором отдельные мономеры находятся в антипараллельной ориентации. При расположении в качестве димера, S100A12, как сообщается, секвестр »n2″, а также другие divalent ионов металла, например, Cu2 “с высоким сродством7. Эти ионы координируются в интерфейсе S100A12 dimer аминокислотами H15 и D25 одного подразделения и H85, а также H89 антипараллельного другого подразделения8,9,10. В то время как более ранние исследования предполагают, что «n2»– загруженный S100A12 может вызвать организацию белка в гомо-тетрамеры (44 kDa) и привести к увеличению Ca2 “сродство11,12, недавняя металлическая титровка исследования6 показывают, Ca 2 “-связывание s100A12, чтобы увеличить сродство белка к »n2 “. После того, как S100A12 EF-руки полностью заняты Ca2 “,дополнительные Ca2 “, как полагают, связывать между димерами, вызывая образование гексемеров (примерно 63 kDa). Архитектура хексамерной квартальной структуры явно отличается от тетрамерной. Предлагается, что интерфейс тетрамера нарушается, чтобы привести к новым димер-димер интерфейсы, которые выгоды hexamer формирования10. S100A12 почти исключительно выражается человеческими гранулоцитами, где она составляет около 5% всего цитосолильного белка13. В своей функции DAMP S100A12 исторически был описан как агонист рецептора мульти-лиганд для передовых конечных продуктов гликации (RAGE), а затем назвал внеклеточной вновь выявленных RAGE-связывающий белок (EN-RAGE)14. Хотя мы ранее сообщили биохимических S100A12-связывания как RAGE и TLR415, мы недавно продемонстрировали человеческие моноциты реагировать на S100A12 стимуляции в TLR4-зависимым образом16. Это требует расположения S100A12 в его Ca2 “/n2″-индуцированной hexameric quarternary структуры16.
Здесь мы описываем процедуру очистки для рекомбинантного человека S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток16,17. Это основано на двухступенчатой стратегии хроматографии, которая первоначально включает в себя колонку обмена анионов для изоляции и концентрации белка и удаления объемных загрязнений (например, эндотоксины/липополисахариды)18. Ионно-обменная хроматография мели с разъединяет белки на основе различных чистых поверхностных зарядов. Для кислых белков, таких как S100A12 (изоэлектрическая точка 5,81), буферная система с рН 8,5 и сильной анион-обменной мисиной приводит к хорошему разделению. Связанные белки были eluted с высоким содержанием соли буферград градиента. С увеличением ионной силы отрицательные ионы в элютионном буфере конкурируют с белками за заряды на поверхности мисинки. Белки индивидуально elute в зависимости от их чистого заряда и в результате этого, буферы, описанные в настоящим, позволяют изолировать и сконцентрировать переэкспрессии S100A12 белка. Из-за отрицательно заряженных групп в липополисахаридах, эти молекулы также связываются с анион-обменом мишенями. Однако их более высокий чистый заряд приводит к более позднему выращению приприменении высокосолевого градиента. Для полировки введен второй этап процедуры очистки. Это делает использование кальция связывающей способности S100A12 и удаляет оставшиеся примеси на гидрофобных взаимодействия колонки. Связывание кальция S100A12 приводит к конформационным изменениям и воздействию гидрофобных пятен на поверхность белка. При этом условии S100A12 взаимодействует с гидрофобной поверхностью мисы. После кальция-chelating ЭДТА, это взаимодействие вспять. При наличии ионов, особенно кальция и цинка, S100A12 устраивается в гомомерные олигомеры. Для изучения структурно-функциональных отношений различных олигомеров мы стабилизировали димерические, тетрамерные и гексамерные рекомбинантные S100A12 с химическим кросслинкером и разделили комплексы на столбец хроматографии размеров исключения. Наконец, для анализа функциональности и биологической активности очищенного белка и его ионно-индуцированных олигомеров можно сравнить высвобождение цитокинов S100A12 и LPS стимулируемых моноцитов.
До сих пор описаны различные методы очистки S100A12. Джексон и др.19, например, опубликовал протокол с очищением через колонку обмена анионом и последующего размера исключения хроматографии. Полировка очистки на столбце исключения размера приводит к хорошим результатам, но, например, из-за ограниченных объемов загрузки, менее гибкая по масштабируемости. Другой подход, опубликованный Kiss et al.20, описывает очищение помеченного белка через колонку сродства Ni2 в качестве первого шага очистки, а затем ферментативного расщепления для удаления тега и дальнейших шагов по очистке. В отличие от вышеупомянутых исследований19,20, производится белка, как описано в этом протоколе определяется для экспериментов на иммунных клетках. Таким образом, остатки эндотоксина загрязнения от бактериальной культуры является проблемой. Хотя различные подходы для удаления эндотоксинов были описаны до сих пор, нет единого метода, который работает одинаково хорошо для любого данного белковогораствора 21,22.
Таким образом, наш протокол сочетает в себе преимущества безметного выражения в бактериальной системе с эффективным удалением эндотоксинов и высокой урожайностью чистого белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы описываем безметиваемую бактериальную экспрессию человека S100A12 и его очищение, а также разделение на различные ионные олигомеры для стимуляции иммунных клеток. По сравнению с опубликованной литературой по очистке белка S100A128,23,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами от интрамуральной инновационной медицинской исследовательской программы медицинского факультета Университета Мюнстера (KE121201 до C.K.) и Немецкого исследовательского фонда (DFG, Fo354/3-1 до D.F.).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
Riferimenti
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. . Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. . Application Note – Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation – The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
