Rening av Human S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för immun cells stimulering
Summary
Detta protokoll beskriver en reningsmetod för rekombinant taggfritt kalcium bindnings protein S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för humana monocytstimuleringstester.
Abstract
I detta protokoll beskriver vi en metod för att rena humant kalcium-bindande protein S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer från Escherichia coli kultur för immun cell stimulationer. Detta protokoll är baserat på en tvåstegs kromatografistrategi, som omfattar protein för rening på en anjonbyteskromatografi och ett efterföljande polersteg på en hydrofoba-interaktionskolonn. Denna strategi producerar S100A12 protein med hög renhet och avkastning till hanterbara kostnader. För funktionella analyser på immunceller krävs en noggrann övervakning och ytterligare rengöringsåtgärder för att erhålla endotoxin-fritt protein. Merparten av endotoxinet kontamineringar kan uteslutas genom anjonbyteskromatografi. För att tömma rester av föroreningar, beskriver detta protokoll ett avlägsnande steg med centrifugalfilter. Beroende på den tillgängliga Jon-styrka S100A12 kan ordna i olika homomultimers. För att undersöka sambandet mellan struktur och funktion, beskriver detta protokoll ytterligare jonbehandling av S100A12 protein följt av kemisk tvärbindning för att stabilisera S100A12 oligomerer och deras efterföljande separation efter storleks uteslutning Kromatografi. Slutligen beskriver vi en cellbaserad analys som bekräftar den biologiska aktiviteten hos det renade proteinet och bekräftar LPS-fri beredning.
Introduction
S100A12 är ett kalcium bindnings protein som huvudsakligen framställs av humana granulocyter. Proteinet är överuttryckt under (systemisk) inflammation och dess serumnivåer, särskilt i (Auto) inflammatoriska sjukdomar som systemisk juvenil idiopatisk artrit (sJIA), familjär medelhavs feber (FMF) eller Kawasakis sjukdom (KD) kan informera om sjukdomsaktivitet och behandlingssvar. Beroende på mönsterigenkänning receptorer (PRRs) såsom Toll-liknande receptorer (TLRs), det medfödda immunförsvaret kan aktiveras av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) som lipopolysackarider (LPS) eller skada associerade molekylära mönster (DAMPs; kallas också “alarmins”). DAMPs är endogena molekyler såsom cellulära proteiner, lipider eller nukleinsyror1. Fukt-funktioner är väl beskrivna för medlemmarna i calgranulin protein familjen, S100A8/A9 och S100A122, som också rapporteras att fungera som tvåvärda metall Ion-kelering antimikrobiella peptider3,4, 5,6. Beroende på tillgänglig jonstyrka kan S100A12, liksom andra medlemmar av S100 familjen, arrangera i olika homomultimers och tills nyligen effekterna av S100A12-oligomerisation på PRR-interaktion, särskilt TLR4, var okänd.
Proteinernas monomerform (92 aminosyror, 10,2 kDa) består av två EF-hand Helix-loop-Helix strukturer som förbinds med en flexibel länkare. C-terminalen EF-hand innehåller det klassiska ca2 +-bindande motivet medan N-terminalen EF-hand uppvisar en S100 proteinspecifik utökad loop struktur (“pseudo-EF-hand”) och avslöjar reducerad ca2 +-affinitet. Ca2 +-bindning av S100A12 kan inducera en större konformationsförändring i proteinerna C-Terminus, vilket resulterar i exponering av ett hydrofoba plåster på varje monomer och bildar Dimerization gränssnittet. Sålunda, under fysiologiska förhållanden, den minsta kvartärgeologi struktur som bildas av S100A12 är en icke-kovalent dimer (ca 21 kDa) där enskilda monomerer är i antiparallell orientering. När arrangeras som dimer, S100A12 rapporteras till binda Zn2 + samt andra tvåvärda metalljoner, e.g., Cu2 + med hög affinitet7. Dessa joner koordineras på S100A12 dimer att samverka vid amino syror H15 och D25 av en subenhet och H85 as well as H89 av anti-parallellingen annan subenhet8,9,10. Medan tidigare studier föreslår att Zn2 +-Loaded S100A12 kan inducera proteiners organisation till Homo-tetramers (44 kDa) och att resultera i ökad ca2 +-affinitet11,12, senaste metalltitrering studier6 föreslå ca2 +-bindande av S100A12 att öka proteinens affinitet till Zn2 +. När S100A12 EF-händerna är fullt upptagna av ca2 +, är ytterligare ca2 + tänkt att binda mellan dimers, utlöser hexamer formation (ca 63 kDa). Arkitekturen av den hexameric kvartenär strukturerar är klart olik från det av tetrameren. Det föreslås att tetramer gränssnittet störs för att ge upphov till nya dimer-dimer gränssnitt som gynnar hexamer formation10. S100A12 är nästan uteslutande uttrycks av humana granulocyter där det utgör cirka 5% av alla cytosoliska protein13. I dess fuktigt fungera S100A12 beskrevs historically som agonist av mång–ligand receptor för avancerade glycation slut-produkter (ursinne), därefter kallat extracellulära nyidentifierat RAGE-binding protein (EN-RAGE)14. Även om vi tidigare rapporterat biokemiska S100A12-bindande för både RAGE och TLR415, vi visade nyligen mänskliga monocyter att reagera på S100A12 stimulering på ett TLR4-beroende sätt16. Detta kräver arrangemang av S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-inducerad hexameric kvartenär struktur16.
Här beskriver vi en renings procedur för rekombinant human S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för immun cells stimuleringar16,17. Detta är baserat på en tvåstegs kromatografistrategi, som inledningsvis innehåller en anjonbyteskolumn för att isolera och koncentrera proteinet och ta bort bulkföroreningar (t. ex. endotoxiner/lipopolysackarider)18. Jonbyteskromatografi hartser separerar proteiner på grundval av olika netto ytladdningar. För sura proteiner som S100A12 (isoelektrisk punkt 5,81), ett buffertsystem med ett pH på 8,5 och en stark anjonbytarharts leder till en bra separation. Bundna proteiner var eluerade med en hög salt buffert gradient. Med en ökning av jonisk styrka negativa joner i elutionsbufferten konkurrera med proteiner för laddningar på ytan av hartset. Proteiner individuellt eluera beroende på deras netto avgift och i följd av detta, buffertarna beskrivs häri gör det möjligt att isolera och koncentrera överuttryckt S100A12 protein. På grund av negativt laddade grupper i lipopolysackarider, dessa molekyler binder också till anjonbytarhartser. Emellertid resulterar deras högre netto laddning i mer sistnämnd eluering i den applicerade High-salt lutningen. Det andra steget i renings förfarandet har införts för polering ändamål. Detta utnyttjar kalcium bindnings förmågan hos S100A12 och avlägsnar kvarvarande orenheter på en hydrofoba-interaktionskolonn. Kalcium bindning av S100A12 leder till en konformationsförändring och en exponering av hydrofoba fläckar på ytan av proteinet. På detta villkor, S100A12 interagerar med hydrofoba ytan av hartset. Vid kalcium-kelering av EDTA, denna interaktion är omvänd. I närvaro av joner, särskilt kalcium och zink, S100A12 arrangerar i homomeriska oligomerer. För att studera struktur-funktion relationer av de olika oligomererna, stabiliserades vi dimeric, tetrameriska och hexameric rekombinant S100A12 med en kemisk crosslinker och separerade komplexen på en storlek-uteslutning kromatografi kolonn. Slutligen, för att analysera funktionalitet och biologisk aktivitet av det renade proteinet och dess Jon-inducerad oligomerer, cytokin frisättning av S100A12 och LPS stimuleras monocyt kan jämföras.
Olika metoder för rening av S100A12 har hittills beskrivits. Jackson et al.19publicerade till exempel ett protokoll med rening via en anjonbyteskolumn och en efterföljande kromatografi med storleks uteslutning. Rening polering på en storlek-uteslutning kolumn leder till goda resultat, men ― på grund av till exempel begränsad lastning volymer ― är mindre flexibel i skalbarhet. En annan metod, publicerad av Kiss et al.20, beskriver rening av märkta protein via ni2 + affinitetskolonn som första reningssteg, följt av enzymatisk klyvning för att ta bort taggen och ytterligare reningssteg. I motsats till de aforecited studierna19,20, det producerade proteinet som beskrivs i detta protokoll bestäms för experiment på immunceller. Därför är rester av endotoxin från bakteriekulturen en utmaning. Även om olika metoder för avlägsnande av endotoxin har beskrivits hittills finns det ingen enhetlig metod som fungerar lika bra för en given proteinlösning21,22.
Sammanfattnings, vårt protokoll kombinerar fördelarna med en tagg-fritt uttryck i ett bakterie system med effektiv endotoxin avlägsnande och hög avkastning av rent protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi taggfria bakteriella uttryck för Human S100A12 och dess rening samt separation i olika Jon-inducerad oligomerer för immun cell stimulering. Jämfört med publicerad litteratur om S100A12 Proteinrening8,23,24, användning av hög CaCl2 (25 mm) i hydrofoba-interaktionskromatografi är att vår kunskap unik. Flera protokoll som tillämpar koncentrationer från 1 till 5 mM producerar rent …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från interna innovativa medicinska forskningsprogram av Muenster University Medical fakultet (KE121201 till C.K.) och den tyska Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 till D.F.).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
Riferimenti
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. . Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. . Application Note – Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation – The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
