Electroporation metode for in vivo levering av plasmider DNA i Adult sebrafisk Telencephalon
Summary
Presentert her er en electroporation metode for plasmider DNA-levering og ependymoglial cellemerking i den voksne sebrafisk Telencephalon. Denne protokollen er en rask og effektiv metode for å visualisere og spore individuelle ependymoglial celler og åpner opp nye muligheter til å anvende electroporation til et bredt spekter av genetiske manipulasjoner.
Abstract
Electroporation er en transfeksjoner metode der et elektrisk felt brukes til celler for å skape midlertidige porer i en celle membran og øke sin permeabilitet, og dermed tillater ulike molekyler å bli introdusert til cellen. I denne utredningen, electroporation brukes til å innføre plasmider til ependymoglial celler, som linje ventrikkel sonen av den voksne sebrafisk Telencephalon. En brøkdel av disse cellene viser stilk cellen egenskaper og genererer nye neurons i sebrafisk hjernen; Derfor er det viktig å studere deres adferd for å bestemme deres roller i neurogenesis og gjenfødelse. Innføringen av plasmider via electroporation muliggjør lang tidsmerking og sporing av en enkelt ependymoglial celle. Videre kan plasmider som grobunn recombinase eller Cas9 leveres til enkelt ependymoglial celler, som muliggjør gen rekombinasjon eller genredigering og gir en unik mulighet til å vurdere cellenes autonome gen funksjon i en kontrollert, naturlig Miljø. Til slutt, denne detaljerte, steg-for-steg electroporation protokollen brukes til å oppnå vellykket innføring av plasmider i et stort antall enkelt ependymoglial celler.
Introduction
Sebrafisk er utmerket dyr modeller å eksamen hjerne gjenfødelse etter en stikke såret skaden. I forhold til pattedyr, på den evolusjonære stigen, mindre utviklet seg arter som sebrafisk generelt viser høyere forekomst av konstituerende neurogenesis og bredere områder av voksen nevrale stilk cellen bolig, som fører til konstant generering av nye neurons hele de fleste hjerneområder i det voksne livet. Denne funksjonen ser ut til å relatere med betydelig høyere regenererende kapasitet på sebrafisk i forhold til pattedyr1, som sebrafisk har bemerkelsesverdig potensial til å effektivt generere nye neurons i de fleste hjerneskade modeller studert2, 3,4,5,6,7,8. Her er sebrafisk Telencephalon studert, siden det er et hjerne område med fremtredende neurogenesis i voksen alder. Disse sonene av voksne neurogenesis er homologe til neurogenic soner i den voksne pattedyr hjernen9,10,11.
Rikelig neurogenic områder i sebrafisk Telencephalon er til stede på grunn av eksistensen av radial glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungere som Resident Adult neural stamceller og er ansvarlig for generering av nye neurons i både intakt og regenererende hjerne3,5. Sporing av slektslinje har vist at ventrikkel ependymoglia reagerer på skade, deretter sprer og genererer nye neuroblasts som migrerer til lesjon området5. På grunn av den vrenges ut natur sebrafisk Telencephalon, ependymoglial celler linje ventrikkel overflaten og bygge ventrale ventrikkel veggen. Rygg ventrikkel veggen er formet av et rygg ependymal celle lag (figur 1a). Viktigere, sebrafisk ependymoglia legemliggjøre karakteristikkene av både pattedyr radial glia og ependymal celler. Lange radial prosesser er et typisk trekk ved radial glia celler, mens cellulære utvidelser og tette veikryss (så vel som deres ventrikkel posisjoner) er typiske trekk ved ependymal celler12,13,14. Derfor er disse cellene referert til som ependymoglial celler.
Å følge in vivo atferden til enkelt ependymoglial celler under regenerering, de må være pålitelig merket. Ulike metoder for in vivo cellemerking for fluorescerende mikroskopi har vært tidligere beskrevet, for eksempel endogene journalister eller lipofile fargestoffer15. Disse metodene, i motsetning til electroporation, kan kreve lengre tidsperioder og ofte ikke gir mulighet for enkelt cellemerking eller permanent langsiktig tracing. Electroporation, men (foruten enkelt cellemerking), tilbyr muligheten for å innføre nye DNA inn i verten cellen. Videre, sammenlignet med andre metoder for DNA-overføring i cellene, electroporation har vist seg å være en av de mest effektive metodene16,17,18,19.
Presentert her er en electroporation protokoll som har blitt raffinert med det formål å merke enkelt ependymoglial celler i den voksne sebrafisk Telencephalon. Denne protokollen tillater merking av single ependymoglial celler for å følge dem over en langsiktig periode20 eller for å manipulere spesifikke trasé i en celle-autonome måte21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne electroporation protokollen er en pålitelig in vivo-metode for merking av individuelle ependymoglial celler. Protokollen kan trenge en ytterligere tilpasning for å merke andre celletyper som nevroner eller oligodendrocytes. For å oppnå vellykket merking, kan plasmider som inneholder ulike arrangører brukes. Chicken-beta utgangen promoter, eF1alpha, CMV og ubiquitin promoter har tidligere blitt brukt til å drive uttrykk for ulike transgenes i ependymoglia og deres avkom23. Imidlertid bl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Spesiell takk til James Copti for redigering av manuskriptet. Vi har også takknemlig erkjenner finansiering til JN fra German Research Foundation (DFG) av SFB 870 og SPP “Integrative Analysis of luktesans” og SPP 1738 “Emerging roller av ikke-koding RNAs i nervesystemet utvikling, plastisitet & sykdom”, SPP1757 ” Gliacellene heterogenitet “, og Excellence Strategy innenfor rammen av München Cluster for Systems nevrologi (eks 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
Riferimenti
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
