Электропорация Метод для In Vivo Доставка плазмидной ДНК в взрослых зебрафиш теленефалион
Summary
Здесь представлен метод электропорации для плазмидной доставки ДНК и эпендимолиальной маркировки клеток во взрослой теленцефалоне зебры. Этот протокол является быстрым и эффективным методом визуализации и отслеживания отдельных эпендимолиальных клеток и открывает новые возможности для применения электропорации к широкому спектру генетических манипуляций.
Abstract
Электропорация является методом трансфекции, при котором электрическое поле применяется к клеткам для создания временных пор в клеточной мембране и повышения ее проницаемости, тем самым позволяя различным молекулам быть введены в клетку. В этой работе, электропорация используется для введения плазмиды эпиддийных клеток, которые выстраиваются в желудочковой зоне взрослого теленцефалона зебры. Часть этих клеток показывает свойства стволовых клеток и генерирует новые нейроны в мозге зебры; Поэтому, изучение их поведения имеет важное значение для определения их роли в нейрогенезе и регенерации. Внедрение плазмидов с помощью электропорации позволяет долгосрочно маркировать и отслеживать одну эпендимолиальную клетку. Кроме того, плазмиды, такие как рекомбиназа cre или Cas9, могут быть доставлены в одиночные эпендимолиальные клетки, что позволяет рекомбинации генов или редактирования генов и предоставляет уникальную возможность оценить функцию автономного гена клетки в контролируемой, естественной Среды. Наконец, этот подробный, пошаговой протокол электропорации используется для успешного внедрения плазмидов в большое количество одиночных эпиддимолиальных клеток.
Introduction
Зебрафиш являются отличными моделями животных для изучения регенерации мозга после травмы раны. По сравнению с млекопитающими, на эволюционной лестнице, менее развитые виды, такие как зебра, как правило, показывают более высокие показатели составного нейрогенеза и более широкие области взрослого нейронных стволовых клеток жительства, что приводит к постоянному генерации новых нейронов во всем большинство областей мозга во взрослой жизни. Эта особенность, как представляется, коррелируют со значительно более высокой регенеративной способности зебры по сравнению с млекопитающими1, как зебрацы имеют замечательный потенциал для эффективного создания новых нейронов в большинстве моделей травмы мозга изучены2, 3,4,5,6,7,8. Здесь изучается теленцефалон зебры, так как это область мозга с выдающимся нейрогенезом во взрослом возрасте. Эти зоны взрослого нейрогенеза гомологичны к нейрогенным зонам в взрослом мозге млекопитающих9,10,11.
Обильные нейрогенные области в теленефалион зебрафиш присутствуют из-за существования радиальной глии, как клетки или клетки эпиндимолии. Эпендимоглиальные клетки действуют как резиденты взрослых нервных стволовых клеток и несут ответственность за генерацию новых нейронов как в нетронутой и регенерирующей мозга3,5. Эксперименты по отслеживанию линии показали, что желудочковая эпендимолия реагирует на травмы, затем размножается и генерирует новые нейробласты, которые мигрируют на место поражения5. Из-за вечной природы теленефалиона зебры, эпендимолиальные клетки выстраиваются в линию поверхности желудочка и строят стенку желудочков. Стенка желудочковых суставов образуется слоем эпидимальных клеток(рисунок 1A). Важно отметить, что зебрафиш ependymoglia воплощают характеристики как млекопитающих радиальной глии и эпендимальных клеток. Длинные радиальные процессы являются типичной особенностью клеток радиальной глии, в то время как клеточные расширения и плотные соединения (а также их желудочковые положения) являются типичными особенностями эпендимальных клеток12,13,14. Таким образом, эти клетки называются эпедимолийными клетками.
Чтобы следить за поведением in vivo одиночных эпедимолиальных клеток во время регенерации, они должны быть надежно помечены. Различные методы in vivo маркировки клеток для флуоресцентной микроскопии были ранее описаны, такие как эндогенные репортеры или липофильные красители15. Эти методы, в отличие от электропорации, могут потребовать более длительных периодов времени и часто не дают возможности маркировки одной клетки или постоянного долгосрочного отслеживания. Электропорация, однако (кроме одноклеточной маркировки), предлагает возможность введения новой ДНК в клетку-хозяина. Кроме того, по сравнению с другими методами передачи ДНК в клетки, электропорация была продемонстрирована как один из самых эффективных методов16,17,18,19.
Представлен протокол электропорации, который был усовершенствован с целью маркировки отдельных эпеничных клеток во взрослом теленефалии зебры. Этот протокол позволяет маркировки одного эпенимолитальных клеток для того, чтобы следовать за ними в течение длительного периода20 или манипулировать конкретными путями в клеточной автономной манере21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол электропорации является надежным методом in vivo для маркировки отдельных эпиндимольных клеток. Протокол может потребоваться дальнейшая адаптация для обозначения других типов клеток, таких как нейроны или олигодендроциты. Для достижения успешной маркировки можно использ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Особая благодарность Джеймсу Копти за редактирование рукописи. Мы также с благодарностью признаем финансирование JN от Немецкого научно-исследовательского фонда (DFG) по SFB 870 и SPP “Интегративный анализ Olfaction” и SPP 1738 “Новые роли не кодирования РНК в развитии нервной системы, пластичность и болезни”, SPP1757 ” Глиальная неоднородность” и Стратегия превосходства в рамках Мюнхенского кластера системной неврологии (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
Riferimenti
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
