Generering av definerte genomisk modifikasjoner bruke CRISPR-CAS9 i Human Pluripotent stamceller
Summary
Denne protokollen gir en metode for å forenkle generering av definerte heterozygot eller homozygote nukleotid endringer ved hjelp av CRISPR-CAS9 i menneskelige Pluripotent stamceller.
Abstract
Humane Pluripotent stamceller tilbyr et kraftig system for å studere gen funksjon og modellspesifikke mutasjoner som er relevante for sykdommen. Generering av presise heterozygot genetiske modifikasjoner er utfordrende på grunn av CRISPR-CAS9 mediert indel formasjon i den andre allel. Her demonstrerer vi en protokoll for å bidra til å overkomme dette problemet ved å bruke to reparasjons maler der bare én uttrykker ønsket sekvens endring, mens begge malene inneholder stille mutasjoner for å forhindre ny skjæring og indel dannelse. Denne metodikken er mest fordelaktig for genredigering koding regioner av DNA for å generere isogenic kontroll og mutant menneskelig stilk cellen linjer for å studere menneskelig sykdom og biologi. I tillegg har optimalisering av transfeksjoner-og screening-metoder blitt utført for å redusere arbeidskraft og kostnader for et gen redigerings eksperiment. Samlet sett er denne protokollen allment aktuelt for mange Genova redigering prosjekter utnytte den menneskelige pluripotent stilk cellen modell.
Introduction
Human embryonale stamceller (hESCs) og indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) er verdifulle verktøy for modellering menneskelig sykdom på grunn av deres kapasitet for fornyelse, og samtidig opprettholde muligheten til å generere celletyper av forskjellige linjene1,2 ,3,4. Disse modellene åpner muligheten for å forhøre genet funksjon, og forstå hvordan spesifikke mutasjoner og fenotyper er knyttet til ulike sykdommer5,6. Men for å forstå hvordan en bestemt endring er knyttet til en bestemt fenotype, er bruken av en sammenkoblet isogenic kontroll og mutant cellelinjer viktig for å kontrollere for linje til linje variasjon7,8. Transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser (TALENs) og sink finger nukleaser har blitt brukt til å generere innsetting eller sletting (indeler) mutasjoner i ulike genetiske modeller, inkludert primær celler; men disse nukleaser kan være tungvint å bruke og dyre9,10,11,12,13,14. Oppdagelsen av gruppert regelmessig oppdelt kort palindromic gjenta (CRISPR)-CAS9 nuklease har revolusjonert feltet på grunn av effektivitet i indel formasjon i nesten hvilken som helst region av Genova, enkelhet i bruk, og reduksjon i kostnader15 , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19i denne.
En utfordring i å bruke CRISPR-CAS9 baserte Genova redigerings teknologi har vært generering eller korrigering av spesifikke mutasjoner i en allel uten å skape en indel mutasjon i den andre allel20. Hovedmålet med denne protokollen er å overvinne denne utfordringen ved å bruke to enkelt-strandet oligonukleotid (ssODN) reparasjon maler for å redusere indel formasjon i den andre allel. Begge ssODNs er designet for å inneholde tause mutasjoner for å hindre re-skjæring av CAS9 nuklease, men bare en inneholder endring av interesse. Denne metoden øker effektiviteten ved å generere en bestemt heterozygot genetisk modifisering uten å indusere indel formasjon i den andre allel. Ved hjelp av denne protokollen, genredigering eksperimenter i seks uavhengige genomisk steder demonstrere presis innføring av ønsket genomisk endring i en allel uten indel formasjon i andre allel og oppstår med en generell virkningsgrad på ~ 10%. Den beskrevne protokollen er tilpasset fra Maguire et al.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen, bruk av CRISPR-CAS9 sammen med to ssODN reparasjon maler for å generere spesifikke heterozygot eller homozygote Genova endringer er demonstrert i humant Pluripotent stamceller. Denne metoden resulterte i en vellykket generasjon av isogenic cellelinjer uttrykker heterozygot genomisk endringer med en virkningsgrad nær 10%. Denne protokollen er optimalisert for både menneskelige ESCs og iPSCs vokst på bestrålt MEFs som støtter cellevekst og overlevelse etter dyrking celler ved lav tetthet etter ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av finansiering fra National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health gjennom tilskudd U01HL099656 (P.G. and D.L.F.) og U01HL134696 (P.G. and D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
