Summary

גישה פשוטה לבצע מדידות הטיר באמצעות עצמית וולט-אמפר מונה עם תדר פלט ניתן לתיכנות

Published: October 05, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מדגימים כיצד להגדיר וולט-אמפר-מונה זול עם תדר פלט מיתכנת שניתן להשתמש בו עם המקל מסחרית זמין אלקטרודות עבור transepi, מדידות התנגדות חשמלית החשמל.

Abstract

שימוש בטרספפיתל/ההתנגדות החשמלית של שנות ה-80 לקביעת שליטה וחדירות במערכות מודל מבחנה. ברוב המקרים, אלקטרודות המקל משמשות כדי לקבוע את העכבה החשמלית בין התא העליון והתחתון של מערכת להוסיף מסנן התרבות התא המכיל monolayers הסלולר. קרום מסנן מאפשר לתאים לדבוק, הקיטוב, ואינטראקציה על ידי בניית צמתים הדוקים. טכניקה זו תוארה עם מגוון של קווי תאים שונים (למשל, תאים של מחסום הדם-מוח, מחסום נוזלי שדרתי דם, או מערכת העיכול והריאות). התקני המדידה העגלון ניתן להשיג בקלות מספקים שונים ציוד מעבדה. עם זאת, יש פתרונות חסכוניים יותר ומותאמים להתאמה אישית, אם אתה מקבל הרכבה עצמית מתאימה. המטרה הכוללת של פרסום זה היא להגדיר מכשיר אמין עם תדר פלט ניתן לתכנות, כי יכול לשמש עם המקל מסחרית המקלות זמין עבור מדידה הטיר.

Introduction

תאים אפיתל ואנדותל לתפקד כגבולות הסלולר, הפרדת הצדדים פסגה והצלעות של הגוף. אם הם מקושרים באמצעות צמתים הדוקים, החומר הפסיבי דיפוזיה דרך החללים הפרתאיים מוגבל1, והתוצאה היא היווצרות של מכשול חדיר בררני. כמה מערכות מחסום מלאכותי פותחו2 שימוש בתאי מיקרו-כלי (hbmec, מחסום דם-מוח3,4,5,6,7), מקלעת דמית תאים אפיתל (hibcpp/pcpec דם-שדרתי מחסום נוזלשדרה 8,9,10,11,12,13,14), המעי הגס אדנוקרצינומה תאים (caco-2, מודלים במערכת העיכול15), או קווי נשימה/מכתשי תא (מודליםריאתי16,17). מערכות אלו מורכבות בדרך כלל תאים הגדלים במונאולייר על ממברנות חדירות (כלומר, מערכות להוסיף מסנן) כדי לאפשר גישה לצדדים הקודקוד והבזלת צלעות. חשוב ששלמות מערכת המודל תתאים לתנאים הvivo. מכאן, טכניקות מספר פותחו כדי לנתח את תפקוד המכשול על ידי מדידת הפצת הפראותאי של תרכובות מעקב על פני שכבת התא. חומרים אלה כוללים הקרינה הדו, אלבומין מתויג בצבע, inulin מתויג FITC, או לצבוע-התווית דקטרנס2. עם זאת, צבעים כימיים יכולים להפוך תאים שמיש לניסויים נוספים. לניטור מערכות המכשול באופן בלתי פולשני, מדידת מערכת ההתנגדות החשמלית של הטראנס-מרחבי הרשת ניתן להשתמשב -2,18,19. בגלל מערכות האלקטרודות דו קוטבית מושפעים העכבה אלקטרודות האלקטרודה בממשק אלקטרודה-אלקטרוליט, מדידות הטארבלפולהם משמשים בדרך כלל כדי להתגבר על הגבלה זו20. הטכניקה התחתונה היא חישה 4-טרמינל (4T) שתוארה לראשונה בשנת 1861 על ידי ויליאם תומסון (לורד קלווין)21. בקיצור, הזרם מוזרק על-ידי זוג אלקטרודות הנושאות את הזרם הנוכחי, בעוד זוג אלקטרודות לחישה במתח השני משמש למדידת מדידת המתח20. כיום, כביכול אלקטרודות המקל מורכב מזוג אלקטרודות כפולות, כל אחד המכיל גלולה כסף/כסף-כלוריד למדידת מתח ואלקטרודות כסף עבור עובר הנוכחי2. העכבה החשמלית נמדדת בין פסגה לבין תא בזלת צלעות עם שכבת התא בין (איור 1). אות גל מרובע בתדר של בדרך כלל 12.5 Hz מוחל על האלקטרודות החיצוניות ואת הזרם הסירוגין המתקבל (AC) נמדד. בנוסף, הירידה הפוטנציאלית לאורך שכבת התא נמדדת על-ידי זוג האלקטרודה השני (הפנימי). העכבה החשמלית מחושבת לאחר מכן על פי חוק אוהם. ערכי העגלון מנורממים על-ידי הכפלת אזור משטח העכבה ושכבת התאים ומבוטאים בדרך כלל כ-Ω ס”מ2.

ישנן מערכות בהן תאים ואלקטרודות מסודרים בצורה מתוחכמת יותר, אך מבוססים גם על עקרון המדידה של 4T וניתן להשתמש בהם עם התקני מדידה זהים. מערכות אנדוhm, למשל, שבו מוכנס המסנן, מכילים תא וכובע עם זוג אלקטרודות קונצנטריים עם מבנה זהה כמו המקל אלקטרודה. צורת האלקטרודות מאפשרת זרימה אחידה יותר של צפיפות הזרם לאורך הקרום, ובכך מפחיתה את הווריאציה בין הקריאות. אפילו יותר מורכב (אבל גם יותר מדויק) הוא חדר Ussing, שבו שכבת התאים מפריד בין שני תאים מלאים בתמיסה של המצלצל22. החדר עצמו יכול להיות מתודלק בחמצן, CO2, או N2, ו מעורבב או שיושלם עם חומרים ניסיוניים. כאשר מתבצעת העברת יונים לרוחב שכבת התא, ניתן למדוד הבדל פוטנציאלי על-ידי שתי אלקטרודות לחישה במתח בסמוך לרקמה. מתח זה מבוטל על-ידי שני אלקטרודות נוכחיות הנושאות בסמוך לשכבת התא. הזרם הנמדד יעניק לאחר מכן את הובלת הרשת וההתנגדות הטרנססיפיתית, המשקפת את שלמות המכשול, ניתן לקבוע22. ניתן גם ליישם את מדידת העגלון על מערכות גוף-על-שבב המייצגות מודלים של רקמת מכשול23,24. מערכות אלה מחקות בתנאים vivo של התאים ולעתים קרובות מורכב ממספר סוגים של תאים, מוערמים אחד מעל השני בשכבות.

הפרוטוקול הבא מסביר כיצד להגדיר voltammeter חסכוני ואמין עם תדר פלט ניתן לתיכנות אשר מייצרת לא הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית לעומת מערכות מדידה זמין מסחרית.

Protocol

1. הרכבת מונה וולט-אמפר בסיסי למדידה העגלון הכינו מטען USB סטנדרטי כמו 5 מספק הכוח של ה-dc, כבל הרחבה USB, מיקרובקר שישמש כמחולל גל מרובע לתיכנות, שני מטרים סטנדרטיים שיכולים למדוד זרם חילופין ומתח כריבוע ממוצע שורש ( True-RMS), ארבעה כבלים עם אטמי בננה, כבל מאריך הטלפון עם מחבר RJ14 נקבה כולל שישה ?…

Representative Results

כדי להשוות את הפעולה של voltammeter בהרכבה עצמית עם עמיתו זמין מסחרית שלה, היתה הקלטה של משני המכשירים הוקלט. כפי שמוצג באיור 2A, מכשיר העזר שנוצר אות גל מרובע עם משרעת של 80 mV ו זמן תנודות של 80 ms, אשר מתאים תדירות של 12.5 Hz, כאשר הפע?…

Discussion

לפני voltammeter ביצוע עצמי ניתן להשתמש בשגרה יומית, זה חיוני כדי לבדוק את המכשיר לתפקוד תקין. במקרה שלנו, חצי שעה של תנודות של 40 ms (12.5 Hz) היה מתוכנת, אבל הזמן תנודות יעיל התברר להיות 60 ms (16.7 Hz). חוסר דיוק זה של פולט הזמן של microcontroller לא היתה לגילוי השפעה על מדידות הטיר. ייתכן שיהיה עדיף לקבוע את התדר המ…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים להררמן ליגגאייר ולמרווין בנדה על העצות המומחים שלהם בתחום האלקטרוטכניקה והאינפורמטיקה.

Materials

120 kOhm resistor General (generic) equipment
Banana plug cables General (generic) equipment
Cables General (generic) equipment
Chopstick electrode Merck Millicell MERSSTX01
Chopstick electrode (alternative) WPI World Precision Instruments STX2
Crimping tool General tool
Digispark / ATtiny85 AZ-Delivery Vertriebs GmbH Digispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12 Gibco (Thermo Fisher) 31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10270106
Filter inserts 3µm translucent Greiner Bioone 662631
HIBCPP Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripper General tool
Luster terminal General (generic) equipment
Oscilloscope HAMEG Digital Storage Scope HM 208
Plotter PHILIPS PM 8143 X-Y recorder
Software Arduino https://www.arduino.cc Arduino 1.8.9
Soldering iron General tool
Soldering lugs General (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector General (generic) equipment
Test resistor Merck Millicell MERSSTX04
True-RMS multimeters VOLTCRAFT VC185
USB charger General (generic) equipment
USB extension cord General (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurement WPI World Precision Instruments EVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) Merck Millicell ERS
Wire end ferrules General (generic) equipment

Riferimenti

  1. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
  2. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
  3. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
  4. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
  5. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  6. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
  7. Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
  8. Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
  9. Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
  10. Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
  11. Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
  12. Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
  13. Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
  14. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
  15. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
  16. Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
  17. Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
  18. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
  19. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  20. Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
  21. Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
  22. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
  23. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
  24. Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
  25. . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
  26. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
  27. Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
  28. Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).
check_url/it/60087?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).

View Video