Qui, dimostriamo come impostare un mitemetro a volt poco costoso con frequenza di uscita programmabile che può essere utilizzato con elettrodi bacchette disponibili in commercio per misurazioni transepiteliali/endoteliali di resistenza elettrica.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un approccio semplice per eseguire misurazioni TEER utilizzando un Amperemetro Volt-Amperemeter self-made con frequenza di uscita programmabile
In questo articolo
Sommario
Abstract
La resistenza elettrica transeteliale/endoteliale (TEER) è stata utilizzata fin dagli anni '80 per determinare la confluenza e la permeabilità dei sistemi modello di barriera in vitro. Nella maggior parte dei casi, gli elettrodi delle bacchette vengono utilizzati per determinare l'impedimento elettrico tra il compartimento superiore e inferiore di un sistema di inserimento del filtro di coltura cellulare contenente monostrati cellulari. La membrana del filtro consente alle cellule di aderire, polarizzare e interagire costruendo giunzioni strette. Questa tecnica è stata descritta con una varietà di diverse linee cellulari (ad esempio, cellule della barriera emato-encefalica, barriera del liquido emato-cerebrospinale, o tratto gastrointestinale e polmonare). I dispositivi di misura TEER possono essere facilmente ottenuti da diversi fornitori di apparecchiature di laboratorio. Tuttavia, ci sono soluzioni più convenienti e personalizzabili immaginabili se un voltametro appropriato è auto-assemblato. L'obiettivo generale di questa pubblicazione è quello di creare un dispositivo affidabile con una frequenza di uscita programmabile che possa essere utilizzato con elettrodi di bacchetta disponibili in commercio per la misurazione TEER.
Introduzione
Le cellule epiteliali ed endoteliali funzionano come confini cellulari, separando i lati apicali e basolaterali del corpo. Se sono collegati attraverso giunzioni strette, la diffusione passiva della sostanza attraverso gli spazi paracellulari è limitata1, con conseguente formazione di una barriera selettivamente permeabile. Diversi sistemi di barriera artificiale sono stati sviluppati2 utilizzando cellule endoteliali microvascolari (HBMEC, barriera emato-encefalica3,4,5,6,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Assemblaggio di un terrore di base per la misurazione TEER
- Preparare un caricabatterie USB standard come alimentatore 5 V D.C., un cavo di estensione USB, un microcontrollore che verrà utilizzato come un generatore di onde quadrate programmabile, due multimetri standard che sono in grado di misurare la corrente alternata e la tensione come radice media quadrata ( True-RMS), quattro cavi con spine di banana, un cavo di interno telefonico con un connettore femminile RJ14 tra cui sei pin con i quattro cavi interni (6P4C), due cavi corti, un terminale di lucentezza, un pre-resistor a 120 k, ferregole di chiusura del filo e anse di saldatura. Gli strumenti nec....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per confrontare il funzionamento di un voltametro auto-assemblato con la sua controparte disponibile in commercio, è stato registrato un oscillogramma di tensione di entrambi i dispositivi.
Come mostrato nella Figura 2A, lo strumento di riferimento ha generato un segnale di onda quadra con un'ampiezza di 80 mV e un tempo di oscillazione di 80 ms, che corrisponde a una frequenza di 12,5 Hz, quand.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Prima che un voltametro autoprodotto possa essere utilizzato in una routine quotidiana, è essenziale controllare il dispositivo per il corretto funzionamento. Nel nostro caso, un mezzo tempo di oscillazione di 40 ms (12,5 Hz) è stato programmato, ma il tempo di oscillazione effettivo si è rivelato essere 60 ms (16,7 Hz). Questa imprecisione dell'emettitore di tempo del microcontrollore non ha avuto alcun impatto rilevabile sulle misurazioni TEER. Potrebbe essere meglio determinare la frequenza effettiva utilizzando l'imp.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Herman Liggesmeyer e Marvin Bende per la loro consulenza di esperti in elettrotecnica e informatica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| da 120 kOhm | Attrezzatura generale (generica) | ||
| Cavi | a banana Attrezzatura generale (generica) | ||
| Cavi | Attrezzatura generale (generica) Elettrodo | ||
| bacchetta | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Elettrodo a bacchetta (alternativo) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| di crimpatura | Strumento generale | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Siero fetale di vitello (FCS)/Siero fetale bovino (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Inserti filtranti 3µ m traslucido | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Sverniciatore | Strumento generale Terminale | ||
| di lucentezza | Attrezzatura generale (generica) | ||
| Oscilloscopio | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 Registratore XY | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Saldatore | Utensile generico | ||
| Capicorda di saldatura Attrezzatura | generale (generica) | ||
| Cavo telefonico con connettore | Attrezzatura generale (generica) | ||
| Resistenza di prova | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| Multimetri a vero valore efficace | VOLTCRAFT | VC185 | |
| Caricatore | Attrezzatura generale (generica) | ||
| Cavo | Attrezzatura generale (generica) | ||
| Voltohmmetro per la misurazione TEER | WPI World Precision Instruments | Voltohmmetro EVOM | |
| per la misurazione TEER (alternativa) | Merck Millicell | ERS | |
| Capicorda | Attrezzatura generale (generica) |
Riferimenti
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P.,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
