Une approche simple pour effectuer des mesures TEER à l'aide d'une Volt-Amperemètre auto-faite avec fréquence de sortie programmable
Summary
Ici, nous démontrons comment mettre en place un volt-amperemètre bon marché avec la fréquence de sortie programmable qui peut être utilisé avec des électrodes de baguette disponibles dans le commerce pour les mesures de résistance électrique transépithéliale/endothéliale.
Abstract
La résistance électrique transépithéliale/endothéliale (TEER) est utilisée depuis les années 1980 pour déterminer la confluence et la perméabilité des systèmes de modèles de barrières in vitro. Dans la plupart des cas, des électrodes de baguette sont employées pour déterminer l’empedance électrique entre le compartiment supérieur et inférieur d’un système d’insertion de filtre de culture cellulaire contenant des monocouches cellulaires. La membrane du filtre permet aux cellules d’adhérer, de polariser et d’interagir en construisant des jonctions serrées. Cette technique a été décrite avec une variété de différentes lignées cellulaires (par exemple, les cellules de la barrière hémato-encéphalique, la barrière du liquide céphalo-rachidien, ou le tractus gastro-intestinal et pulmonaire). Les dispositifs de mesure TEER peuvent être facilement obtenus auprès de différents fournisseurs d’équipement de laboratoire. Cependant, il existe des solutions plus rentables et personnalisables imaginables si un voltammètre approprié est auto-assemblé. L’objectif global de cette publication est de mettre en place un dispositif fiable avec une fréquence de sortie programmable qui peut être utilisé avec des électrodes de baguette disponibles dans le commerce pour la mesure TEER.
Introduction
Les cellules épithéliales et endothéliales fonctionnent comme des limites cellulaires, séparant les côtés apaïques et basolatéraux du corps. S’ils sont reliés par des jonctions serrées, la diffusion passive de substance s’est étendue1,ce qui entraîne la formation d’une barrière sélectivement perméable. Plusieurs systèmes de barrière artificielle ont été développés2 utilisant des cellules endothéliales microvasculaires (HBMEC, barrière hémato-encéphalique3,4,5,6,7), plexus choroïde cellules épithéliales (HIBCPP/PCPEC, barrière de liquide céphalo-céphalo-céphalo-rachidien8,9,10,11,12,13,14), cellules d’adénocarcinome colorectal (Caco-2, modèles gastro-intestinaux15), ou lignes de cellules alvéolaires (modèles pulmonaires16,17). Ces systèmes sont généralement constitués de cellules cultivées en monocouches sur des membranes perméables (c.-à-d. des systèmes d’insertion de filtre) pour permettre l’accès aux côtés apical et basolatéral. Il est important que l’intégrité du système de modèle corresponde aux conditions in vivo. Par conséquent, plusieurs techniques ont été développées pour analyser la fonction de barrière en mesurant la diffusion paracellulaire des composés de traceur à travers la couche cellulaire. Ces substances comprennent le saccharose radio-étiqueté, l’albumine étiquetée par colorant, l’inuline étiquetée FITC ou le dextrans étiqueté colorant2. Cependant, les colorants chimiques peuvent rendre les cellules inutilisables pour d’autres expériences. Pour surveiller les systèmes de barrière de manière non invasive, la mesure de la résistance électrique transépithéliale/transendothéliale (TEER) à travers une monocouche cellulaire peut être utilisée2,18,19. Étant donné que les systèmes d’électrodes bipolaires sont influencés par l’impedance de polarisation par électrode à l’interface électrode-électrolyte, les mesures tétrapolaires sont généralement utilisées pour surmonter cette limitation20. La technique de sous-imposition est une détection à quatre terminaux (4T) qui a été décrite pour la première fois en 1861 par William Thomson (Lord Kelvin)21. En bref, le courant est injecté par une paire d’électrodes porteuses de courant tandis qu’une deuxième paire d’électrodes de détection de tension est utilisée pour mesurer la chute de tension20. Aujourd’hui, les électrodes dites baguettes se composent d’une paire de doubles électrodes, chacune contenant une pastille argentée/argent-chlorure pour mesurer la tension et une électrode argentée pour passer le courant2. L’impédance électrique est mesurée entre l’apical et le compartiment basolatéral avec la couche cellulaire entre les deux (Figure 1). Un signal d’onde carréà une fréquence généralement de 12,5 Hz est appliqué aux électrodes extérieures et le courant alternatif résultant (AC) mesuré. En outre, la chute potentielle à travers la couche cellulaire est mesurée par la deuxième paire d’électrodes (intérieures). L’impédance électrique est alors calculée selon la loi d’Ohm. Les valeurs TEER sont normalisées en multipliant l’impédance et la surface de la couche cellulaire et sont généralement exprimées en cm2.
Il existe des systèmes dans lesquels les cellules et les électrodes sont disposées d’une manière plus sophistiquée, mais sont également basées sur le principe de mesure 4T et peuvent être utilisées avec les mêmes dispositifs de mesure. Les systèmes EndOhm, par exemple, dans lesquels le filtre est inséré, contiennent une chambre et un bouchon avec une paire d’électrodes concentriques avec la même structure que l’électrode de baguette. La forme des électrodes permet un flux de densité de courant plus uniforme à travers la membrane, réduisant ainsi la variation entre les lectures. Encore plus complexe (mais aussi plus précis) est une chambre Ussing, où une couche cellulaire sépare deux chambres remplies de la solution de Ringer22. La chambre elle-même peut être gazée avec de l’oxygène, CO2, ou N2, et remué ou complété avec des substances expérimentales. Comme le transport d’ions à travers la couche cellulaire se produit, une différence potentielle peut être mesurée par deux électrodes de détection de tension près du tissu. Cette tension est annulée par deux électrodes transportant le courant placées à côté de la couche cellulaire. Le courant mesuré donnera alors le transport d’ion net et la résistance transépithéliale, qui reflète l’intégrité de barrière, peut être déterminée22. La mesure TEER peut également être appliquée sur les systèmes corps-sur-une puce qui représentent les modèles de tissu barrière23,24. Ces systèmes imitent les conditions in vivo des cellules et se composent souvent de plusieurs types de cellules, empilées les unes sur les autres en couches.
Le protocole suivant explique comment mettre en place un voltammètre rentable et fiable avec une fréquence de sortie programmable qui ne produit aucune différence statistiquement significative dans LE TEER par rapport aux systèmes de mesure disponibles dans le commerce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avant qu’un voltammètre self-made puisse être employé dans une routine quotidienne, il est essentiel de vérifier l’appareil pour le fonctionnement approprié. Dans notre cas, un demi-temps d’oscillation de 40 ms (12,5 Hz) a été programmé, mais le temps d’oscillation effectif s’est avéré être de 60 ms (16,7 Hz). Cette inexactitude de l’émetteur de temps du microcontrôleur n’a eu aucun impact détectable sur les mesures TEER. Il pourrait être préférable de déterminer la fréquence réelle en utilisant le r?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Herman Liggesmeyer et Marvin Bende pour leurs conseils d’experts en électrotechnique et en informatique.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
Riferimenti
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