여기서, 우리는 스모 결합 엔티티(SUBEs)를 사용하여 인간 간종 세포및 간 종양으로부터 수득된 인간 간종 세포 및 간 종양모두에서 SUMO에 의해 변형된 단백질을 풍부하게 하고, 분리하고, 식별하고, 특성화하는 프로토콜을 제시한다.
번역 후 수정은 진핵 세포에서 단백질 항상성과 기능을 조절하는 주요 메커니즘입니다. 간암에 있는 모든 유비퀴틴 같이 단백질 중, SUMO (작은 유비퀴틴 MOdifier)에 의하여 수정은 가장 주목을 받았습니다. 생체 내에서 내인성 SUMOylated 단백질의 분리는 활성 SUMO 특이적 프로테아제의 존재로 인해 도전적입니다. 생체 내에서 의 스모일화의 초기 연구는 특정 스모일화 단백질의 분자 검출에 기초하였다 (예를 들어, 서쪽 얼룩에 의해). 그러나, 많은 경우에, 항체는, 일반적으로 비변형 재조합 단백질로 만들어졌으며, 관심 있는 단백질의 스모예화된 형태를 면역침전시키지 않았다. 니켈 크로마토그래피는 스모 분자의 히스티딘 태그 버전을 포착하여 스모일화를 연구하는 또 다른 접근법이었습니다. 이 접근법은 주로 안정적으로 발현하거나 일시적으로 His-SUMO 분자로 형질감염된 세포에서 사용된다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 스모 결합 엔티티(SUBEs)는 내인성 스모일화 단백질을 분리하기 위해 개발되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 SUBEs를 사용하여 간암 마우스 모델로부터 인간 간종 세포 및 간 조직으로부터 의 SOylated 기질의 농축, 격리 및 식별에 필요한 모든 단계를 설명한다. 첫째, 우리는 인간 간종 세포 및 간 종양 조직 샘플의 준비 및 분해에 관여하는 방법을 설명합니다. 이어서, SUBEs 및 대조물의 준비에 대한 철저한 설명은 단백질 풀다운 분석에 대한 프로토콜과 함께 상세히 설명된다. 마지막으로, 스모일화된 프로테오메의 식별 및 특성화, 즉 간 종양으로부터의 특정 스모일화된 기질의 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석의 사용 또는 사용에 사용할 수 있는 옵션에 관한 몇 가지 예가 제공된다. 세포종 세포에서 스모일화된 프로테오메 및 상호작용의 고처리량 특성화를 위한 질량 분석법에 의한 프로테오믹스의.
간암은 전 세계적으로 여섯 번째로 흔한 암이며 암 관련 사망의 두 번째 원인1. 간세포 암종 (HCC)은 1 차적인 간암의 가장 일반적인 양식입니다. 역사적으로, HCC의 발달을 위한 일반적인 위험 요소는 만성 B형 간염 또는 C형 간염 감염 및 학대적인 알콜 소비를 포함했습니다. 지난 수십 년 동안, 대사 증후군, 타입-2 당뇨병 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 HCC2의발달을 위한 위험 인자로 부상하였다. HCC는 매우 이질적이며, 전형적이고 유전적으로, 신호 경로의 복잡한 네트워크가 중단된다는 것을 항성으로 한다. 지난 몇 년 동안, HCC의 병인에 연루된 분자 경로에 대한 지식이 증가했음에도 불구하고 HCC 관리를 위한 효과적인 치료 접근법은 아직 없습니다. 많은 통로는 HCC에서 활성화되고 하나는 일반적으로 다른 통로3에의하여 보상을 구동합니다. 이것은 HCC를 취급할 때 주요 어려움의 한개이었습니다. 따라서, 보다 글로벌한 접근법은 다중 신호화 경로가 단백질의 PTM에 의해 동시에 조절될 수 있기 때문에, 예를 들어, 번역 후 변형(PTM)을 표적으로 하는 간암의 임상 관리를 위한 잠재적인 치료 접근법을 제공할 수 있다.
번역 후 수정은 단백질 항상성 및 기능을 조절하는 주요 메커니즘으로 간주됩니다4. 구조적 및 기능적 변화는 PTM에 의해 도입되어 프로테오메의 다양성을 증가시킵니다. 가장 일반적인 PTM은 인산화, 메틸화, 아세틸화, 글리코실화, 유비퀴틴화 및 유비퀴틴 유사 단백질(UbLs)의 컨쥬게이션을 포함한다. 모든 UbLs 중에서, SUMO (작은 유비퀴틴 MOdifier)에 의한 단백질 수정은 전사, 세포 국소화, DNA 복구 및 세포 주기 진행을 포함한 다양한 세포 과정에 중요한 역할과 관련하여 주목받고 있습니다. 5. 최근, 스모일화는 간암에서 변경되는 것으로 나타났다6,7,8,9,특정 단백질의 스모일화의 변화는 진행에 역할을 하는 것으로 설명되었다 암 관련 질환9.
포유류에는 스모-5까지 5개의 스모 파라로그가 있습니다. 현재까지단백질 수준10,11,12에서내인성 SUMO-4 및 내인성 SUMO-5 접합 반응의 존재에 대한 실험적 증거가 없습니다. 포유류에서의 스모일화는 3가지 효소, 이종성 스모 활성화 효소(SAE1/SAE2) 또는 E1, 스모 컨쥬게이팅 효소(Ubc9) 또는 E2 및 각 표적 단백질에 특이적인 SUMO-E3-리가제를 포함하는 효소 티올-에스테르 캐스케이드에 의해 수행된다. 스모 E3s의 여러 가족의 행동은 스모 특유의 프로테아제(SUSPs 또는 Senps)13과 의 다이내믹한 평형에 있는 것으로 보이며, 스모일레이션 반응을 매우 가역적입니다. 더욱이, 스모일화된 단백질의 극히 일부만 이스모일화된 총 단백질이 존재한다. 이에 따라, 생체 내에서 내인성 스모일화 단백질을 분리하는 것은 오히려13에도전적이다.
생체내에서의 스모일화는 관심있는 단백질에 대하여 항체를 사용하여 서양 얼룩에 의해 처음 연구되었다14. 단백질의 면역 침전은 특정 항체로 수행된 다음 PAGE-웨스턴 블롯을 항-SUMO 항체로 수행하였습니다. 이 전략의 주요 문제점은 비변형 재조합 단백질에 대하여 생성된 항체가 항상 단백질의 SUMOylated 형태를 면역침전할 수 없다는 것이다. 대안적으로, 히스티딘(His6) 버전의 스모 분자및 관심 있는 단백질의 일시적인 발현 후 니켈 크로마토그래피는 세포에서 스모일화를 연구하는데 사용되어 왔다. 이를 바탕으로 His6-SUMO15를안정적으로 발현하는 세포로부터 스모 변형 형태를 검출하는 것이 더 편리할 것이다. 생체내 연구를 위해, 탠덤-스모-상호작용 모티프(SIM) 기반 농축은 폴리스모 접합체16의정제를 입증하였다. 다른 그룹은 1차 세포, 조직 및장기17,18에서내인성 스모일화를 조사하는 실행 가능한 도구를 제공하는 에피토프 태그 항체 SUMO 접근법을 사용하고 있다. 그리고 최근에, Nielsen 및 동료는 세포 및 조직19에있는 내인성 및 사이트 특정 SUMO를 확인하기 위하여 항체 기지를 둔 농축을 이용했습니다.
생체 내에서 스모일레이션의 역할에 대한 보완적인 정보를 제공하기 위해 스모 트랩이라고도 하는 스모 바인딩 엔티티(SUBEs)가20개개발되었습니다. 관련성중, 탠덤 유비퀴틴 결합 엔티티(TUB)는 SUBEs의 개념적 전구체로 간주되며 폴리유비쿼터화단백질(21)의검출 및 격리를 위한 시판되는 도구이다. SUBEs는 SEM의 탠덤 반복을 포함하는 재조합 단백질로, SUMO 기질에 대한 전반적인 친화성의 증가와 함께 변형된 단백질에 대한 SUMO 분자를 인식합니다. 스모 트랩은 E3 유비퀴틴 단백질 리가제 RNF4 유래 SIM2 및 SIM3 모티프를 동시에 도입하여, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)를 함유하는 벡터로, 이종 담체 단백질20을도입하여 설계되었다. SUBEs는 모노 스모일화된 표적 단백질을 확인하기 위해 적절히 사용될 수 없지만, 이 방법은 생체 내에서 폴리-SUMO 표적 단백질의 정제 및 식별을 용이하게 하는 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 인간 간종 세포와 마우스 간 생검에서 모두 스모일화된 단백질을 분리하는 SUBEs의 적용을 설명하며, 간암 연구를 위한 중요한 도구이다. 이 원고에 설명된 프로토콜의 전체 구성표는 그림 1에나와 있습니다.
본 명세서에서, 우리는 간암의 생체 내 모델에서 스모일화된 단백질의 농축, 격리 및 식별 및 특성화를 위한 SUBEs의 사용을 보고하는 방법론에 대한 완전하고 상세한 설명을 제공하였다. 마우스 간 종양과 인간 간종 세포 에서 모두, 우리는 정확하게 관심있는 스모일화 단백질을 분리하고 식별하고 스모일화 된 프로테오메 및 상호 작용의 높은 처리량 특성을 수행 할 수있었습니다. SUBEs의 합성이 이 원고의 범위를 벗어났더라도 자세한 내용은26을참조해야 합니다. 기재된 프로토콜은 빠르고 매우 민감하며, 프로토콜의 중요한 단계는 SENPs 억제제(PR-619)의 사용을 포함한다. 대안적으로, 용해 완충제에서 NEM(N-에틸말레미드) 및 IAA(2-Iodoacetamide)와 같은 화학적 이소펩티다아제 억제제가 사용될 수 있지만, 이전 보고서는 SUBEs 프로토콜의 경우 PR-619의 사용이 다른 것으로 유리하다는 것을 보여주었습니다. 억제제는 글루타티온비드(20)에대한 GST 결합을 방해한다.
SUBEs는 SEM의 탠덤 반복을 포함하는 재조합 단백질로, SUMO 기질에 대한 전반적인 친화성의 증가와 함께 변형된 단백질에 대한 SUMO 분자를 인식합니다. 그것의 높은 특이성 및 감도 때문에, SUBEs의 사용은 에 대하여 항체를 사용하여 특정 SUMOylated 단백질의 서쪽 얼룩에 의하여 검출과 같은 문헌에 있는 그밖 접근에 대하여 유리합니다. 관심있는 단백질 또는 스모 분자의 다른 히스티딘 태그 버전을 사용하여 니켈 크로마토그래피. 그러나 SUBEs 프로토콜이 비 변성 조건하에서 수행됨에 따라 SUMOylated 단백질과 다른 상호 작용 단백질 간의 상호 작용이 유지된다는 점을 고려해야 합니다. 따라서, 우리는 스모일화 표적 단백질의 목록이 아니라 스모 상호 작용에 대한 정보를 얻습니다. 따라서, 확인된 단백질이 SUMO 표적 또는 상호 작용 인자인지 확인하기 위해 추가적인 실험이 필요하다. SUBEs의 그밖 제한은 사용된 통제 GST 트랩이 산화 긴장과 관련있는 많은 배경 단백질을 붙잡을 수 있다는 사실입니다. 이 문제는 기술의 높은 감도로 인해 MS 분석 중에 특히 관련이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 바이오티니티스스포트랩(bioSUBEs)이26개개발되었다. SUBEs의 또 다른 한계는 우리가 SUMO 2와 SUMO 3에 의해 수정된 단백질만포획할 수 있는 반면, SUMO 1-modified 단백질은 분리될 수 없다는 사실에 있습니다.
SUBEs의 사용에 대한 다른 관심사는 절차에 필요한 시작 재료의 양과 관련이 있습니다. SUMOylated 단백질을 포획하는 데 사용되는 시작 물질은 탐구된 다른 실험 조건을 고려해야 합니다. 기저 스모일화는 다양한 세포 문맥에서 보고되었지만, 스모일화는 여러 스트레스 조건/자극 후에 강하게 유도되는 과정입니다. 처리되지 않은 샘플과 처리된 샘플을 비교하는 경우 열이 포화되지 않았는지 확인해야 하며 이러한 조건 간에 차이를 관찰할 수 있습니다. 우리가 분석하고 있는 마우스 표현형의 경우에, 아무 처리도 이용되지 않으며 기초 스모일화 수준은 낮습니다. 이러한 이유로, 단백질의 높은 금액을 사용 했다. 배경 수준은 GST를 사용하여 제어해야 하며 비특이적 바인딩이 높으면 시작 재질의 양이나 바인딩 시간을 줄여야 합니다. FT 분획의 분석은 이러한 트랩이 폴리 스모일화 단백질을 선호하더라도 캡처 효율을 나타낼 수 있으며 총 고갈을 예상해서는 안되며, 캡처 효율이 높을 때 총 스모일화의 감소가 일반적으로 잘 관찰됩니다. 최적의.
마지막으로, SUBEs 기술의 다른 응용 분야에는 SUBEs 기술과 실시간 표면 플라스몬 공명(SPR)의 조합이 포함되어 있어 세포추출물(27)에서스모일화된 단백질과 실시간 상호작용을 가능하게 한다. 또한, 최근에는질량분석분석(26)동안, 예를 들어 더 큰 태그와 관련된 배경을 감소시키는 이점을 가지고 생체생리화된 스모 트랩(bioSUBEs)이 개발되었다. 또한, 바이오수브 버전은 비오틴에 결합하는 스트렙타비딘을 이용하여 뚜렷한 형광 염료로 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 살아있는 세포에서 스모일화된 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 스모일화된 단백질의 검출 및 정량화를 위한 방법은 탠덤 유비퀴틴 결합 엔티티(TUBEs)21과함께 행해진 것과 같은 GST 및 바이오서브스 버전 모두로 고려될 수 있다.
전반적으로, 간암에 관련된 스모일화 된 프로테오메의 격리 및 특성화를위한 SUBEs의 사용은 간암에서 스모일화 경로의 아직 알려지지 않은 역할에 대한 방대한 정보를 제공하는 빠르고 민감한 방법입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 인스티투트 국립 두 암, 프랑스, INCa 교부금 PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (멕시코) 교부금 0280365 및 프랑스 옥시타니의 REPERE 프로그램 (M.S.R.)의 보조금에 의해 지원되었다. 또한, NIH (미국 보건 복지부)-R01AR001576-11A1, 고비에르노 바스코-디데아멘토 데 살루드 2013111114 (M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, 디데리아 델 고비에르노 바스코, 마인코: SAF2017-87301-R 인테그라도 엔 엘 플랜 에스타탈 데 Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (혁신 및 건강 연구를 위한 바스크 재단): EITB 마라토이아 BIO15/CA/014; 인스티투토 드 살루드 카를로스 III:PIE14/00031, integrado en el Plan Estatal de Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (M.L.M.-C), 아소시아시온 에스파냐콘 콘타 엘 칸세르 (T.C.D, M.L.M.M.C.), 다니엘 알길라 EASL (T.C.D에), Fundación Científica 드 라 아소시아시온 에스파뇨라 콘트라 엘 암 (AECC 과학 재단) 희귀 종양 전화 2017 (M.L.M에), 라 카이사 재단 프로그램 (M.L.M에). CIC bioGUNE(SEV-2016-0644)에 대한 세베로 오초아 우수 인증에 대해 MINECO에 감사드립니다.
(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
BSA | Sigma | A4503 | |
C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
DTT | Sigma | 43815 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
EGF | Sigma | e9644 | |
FBS | Life Technologies | 10270 | |
Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
NaCl | Merck | 106404041000 | |
nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
NP40 | Fluka | 74385 | |
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
PR-619 | Merck | 662141 | |
Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |