Tecniche di spettrometria ione Mobilità-Massa per determinare la struttura e i meccanismi del riconoscimento degli ioni metallici e dell'attività di redox degli oligopeptidi di metal linciazione
Summary
La spettrometria di massa io-masse ionica e le tecniche di modellazione molecolare possono caratterizzare le prestazioni selettive di chelatura metallica di peptidi progettati e la metanobattina peptide legante al rame. Lo sviluppo di nuove classi di peptidi chelanti metallici contribuirà a portare alle terapie per le malattie associate allo squilibrio degli ioni metallici.
Abstract
La ionizzazione elettrospray (ESI) può trasferire un peptide a queous-fase o complesso di peptidi alla fase gassosa conservando la sua massa, carica complessiva, interazioni di legame metallico, e forma conformante. L’accoppiamento dell’ESI con la spettrometria di massa iosataria (IM-MS) fornisce una tecnica strumentale che consente di misurazione simultanea della massa di carico (m/z) di un peptide e della sezione trasversale di collisione (CCS) che si riferiscono alla sua stoichiometria, allo stato di e forma conformazionale. La carica complessiva di un complesso di peptidi è controllata dalla protonazione di 1) siti acidi e di base del peptide e 2) lo stato di ossidazione degli ioni metallici. Pertanto, lo stato di carica generale di un complesso è una funzione del pH della soluzione che influisce sull’affinità di legame ios metallico peptidi. Per le analisi ESI-IM-MS, le soluzioni per gli ioni di peptidi e metalli sono preparate da soluzioni acquose, con il pH regolato con acido acetico diluito aqueso o idrossido di ammonio. Ciò consente di determinare la dipendenza da pH e la selettività degli ioni metallici per un peptide specifico. Inoltre, l’m/z e il CCS di un complesso di peptidi possono essere utilizzati con la modellazione molecolare B3LYP/LanL2D per discernere i siti di legame del coordinamento degli ioni metallici e della struttura terziaria del complesso. I risultati mostrano come ESI-IM-MS possa caratterizzare le prestazioni di chelating selettivo di una serie di peptidi alternativi di metanobatteriteina e confrontarli con la metanobattina peptide legante in rame.
Introduction
Gli ioni di rame e zinco sono essenziali per gli organismi viventi e cruciali per i processi tra cui la protezione ossidativa, la crescita dei tessuti, la respirazione, il colesterolo, il metabolismo del glucosio e la lettura del genoma1. Per abilitare queste funzioni, gruppi come il tiolati di Cys, imidazole del Suo2,3, (più raramente) thioether di methionina, e carboxylate di Glu e Asp incorporano selettivamente i metalli come cofattori nei siti attivi di enzimi in metallo. La somiglianza di questi gruppi di coordinamento solleva una domanda intrigante riguardo al modo in cui i ligandi Dei Suoi e dei Cys incorporano selettivamente cu(I/II) o n(II) per garantire il corretto funzionamento.
L’associazione selettiva è spesso realizzata mediante l’acquisizione e la tratta di peptidi, che controllano le concentrazioni di ioni di Cu(I/II)4. Cu(I/II) è altamente reattivo e causa danni ossidativi o legame avventuroso agli enzimi, quindi la sua concentrazione libera è strettamente regolata da chaperones in rame e proteine che regolano il rame che lo trasportano in modo sicuro in varie posizioni nella cellula e strettamente controllare la sua omeostasi5,6. L’interruzione del metabolismo del rame o dell’omeostasi è direttamente implicata nella malattia di Menkes e Wilson7 così come i tumori7 e disturbi neurali, come il prione8 e il morbo di Alzheimer9.
La malattia di Wilson è associata all’aumento dei livelli di rame negli occhi, nel fegato e nelle sezioni del cervello, dove le reazioni di redox di Cu(I/II) producono specie reattive dell’ossigeno, causando degenerazione epatolenticola e neurologica. Le terapie di chelatazione esistenti sono la piccola penicillamina e trietilenetetramina. In alternativa, i peptidi metanoobatteri di rame metatonobatteri (mb)10,11 presentano un potenziale terapeutico a causa della loro elevata affinità legante per Cu(I)12. Quando il metanobatteritina (mb-OB3b) del metilosino trichosporium OB3b è stato studiato in un modello animale della malattia di Wilson, il rame è stato efficacemente rimosso dal fegato ed escreto attraverso la bile13. Gli esperimenti in vitro hanno confermato che mb-OB3b potrebbe masticare il rame dal metallothionein di rame contenuto nel citosol epatico13. Le tecniche di imaging della spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente hanno studiato la distribuzione spaziale del rame nei campioni epatici della malattia di Wilson14,15,16 e hanno dimostrato che mb-OB3b rimuove il rame con brevi periodi di trattamento di soli 8 giorni17.
L’mb-OB3b si legherà anche con altri ioni metallici, tra cui Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) e n(II)18,19. Il concorso per il sito di rilegatura fisiologica Cu(I) è esposto da Ag(I) perché può spostando Cu(I) dal complesso mb-OB3b, con Ag(I) e Ni(II) che mostrano anche un legame irreversibile a Mb che non può essere spostato da Cu(I)19. Recentemente, una serie di oligopeptidi alternativi di metanobatterica (amb) con il motivo di rilegatura 2His-2Cys sono stati studiati20,21, e le loro proprietà di rilegatura di N (II) e Cu(I/II) sono state studiate. Le loro sequenze di amminoacidi primarie sono simili, e contengono tutte il motivo 2His-2Cys, Pro e un N-terminus acetilato. Essi differiscono principalmente da mb-OB3b perché il motivo 2His-2Cys sostituisce i due siti di rilegatura enethiol oxazolone di mb-OB3b.
La ionizzazione dell’elettrospray accoppiata con la spettrometria di massa-massa a ioni (ESI-IM-MS) fornisce una potente tecnica strumentale per determinare le proprietà di legame dei metalli dei peptidi perché misura la loro massa a carica (m/z) e la collisione (CCS) conservando la massa, la carica e la forma conformazionale dalla fase della soluzione. I m/z e ccS si riferiscono alla stochichiometria dei peptidi, allo stato di protonazione e alla forma conformazionale. La stoichiometria è determinata perché l’identità e il numero di ogni elemento presente nella specie sono esplicitamente identificati. La carica complessiva del complesso di peptidi si riferisce allo stato di protonazione dei siti acidi e di base e allo stato di ossidazione degli ioni metallici. Il CCS fornisce informazioni sulla forma conformazionale del complesso di peptidi perché misura la dimensione media rotazionale che si riferisce alla struttura terziaria del complesso. Lo stato di carica generale del complesso è anche una funzione di pH e colpisce l’affinità di legame degli ioni metallici del peptide perché i siti di base deprotonizzati o acidi come il carboxyl, His, Cys e Tyr sono anche i potenziali siti di legame per gli ioni metallici. Per le analisi, il peptide e gli ioni metallici vengono preparati in soluzioni acquose con il pH regolato da acido acetico aluto o idrossido di ammonio. Ciò consente di determinare la dipendenza da pH e la selettività degli ioni metallici per il peptide. Inoltre, l’m/z e la CCS determinati da ESI-IM-MS possono essere utilizzati con la modellazione molecolare B3LYP/LanL2D per scoprire il tipo di coordinamento degli ioni metallici e la struttura terziaria del complesso. I risultati mostrati in questo articolo rivelano come ESI-IM-MS può caratterizzare le prestazioni di chelating selettivo di una serie di amb peptidi e confrontarli con il peptide mb-OB3b di legame di rame.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici: conservazione dei comportamenti della fase della soluzione per l’esame tramite ESI-IM-MS
Devono essere utilizzate impostazioni strumentali ESI native che conservino la stoichiometria dei peptidi, lo stato di carica e la struttura conformazionale. Per le condizioni native, le condizioni nella sorgente ESI, come le tensioni del cono, le temperature e i flussi di gas, devono essere ottimizzate. Inoltre, le pressioni e le tensioni nella sorgente, nella trappola, nella mobilità degli ion…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo materiale si basa sul lavoro supportato dalla National Science Foundation nell’ambito del 1764436, dal supporto dello strumento NSF (MRI-0821247), dalla Welch Foundation (T-0014) e dalle risorse informatiche del Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) e delle comunicazioni l3 . Ringraziamo il gruppo Bower dell’Università della California – Santa Barbara per aver condiviso il programma Sigma e Ayobami Ilesanmi per aver dimostrato la tecnica nel video.
Materials
| acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
| ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
| cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 255599-5G | |
| copper(II) chloride 99.999% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203149-10G | |
| copper(II) nitrate hydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 229636-5G | |
| designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides | Neo BioLab (neobiolab.com) | designed peptides were synthized by order | |
| designed amb5B,C,D,E,F peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
| Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b | cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce) | ||
| glacial acetic acid (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
| Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12357-09 | |
| lead(II) nitrate ACS grade | Avantor (www.avantormaterials.com) | 128545-50G | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203734-5G | |
| MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| nickel chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203866-5G | |
| poly-DL-alanine | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
| silver nitrate 99.9%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 11414-06 | |
| Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
| zinc chloride anhydrous | Alfa Aesar (www.alfa.com) | A16281 |
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