इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत प्रोटीन सकल की विशेषता
Summary
हम अवरक्त नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और उच्च संकल्प परमाणु बल माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णन करने के लिए अल्पजीवी समुच्चय और एमिलॉयड फाइब्रिल्स, जो बारीकी से शुरुआत और विकास के साथ जुड़ा हुआ है में प्रोटीन स्वयं विधानसभा की प्रक्रिया कल्पना मानव neurodegenerative विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला की.
Abstract
प्रोटीन misfolding और एकत्रीकरण की घटना अत्यधिक विषम प्रोटीन समुच्चय के गठन में परिणाम है, जो अल्जाइमर और पार्किंसंस रोगों के रूप में neurodegenerative शर्तों के साथ जुड़े रहे हैं. विशेष रूप से कम आणविक वजन समुच्चय में, एमिलॉयड ओलिगोमर, सामान्य साइटोटॉक्सिक गुणों के अधिकारी को दिखाया गया है और मनोभ्रंश के कई रूपों में neurotoxins के रूप में फंसाया जाता है. हम इन समुच्चय के रूपात्मक, संरचनात्मक और रासायनिक गुणों की विशेषता के चुनौतीपूर्ण कार्य को संबोधित करने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) पर आधारित विधियों के उपयोग को स्पष्ट करते हैं, जिनका पारंपरिक संरचनात्मक उपयोग करके अध्ययन करना कठिन है। उनकी विषमता और क्षणिक प्रकृति के कारण तरीके या थोक जैवभौतिक तरीके। स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण अब उप-नानोमीटर संकल्प के साथ एमिलॉयड समुच्चय की आकृति विज्ञान की जांच करने में सक्षम हैं। हम यहाँ दिखाते हैं कि अवरक्त (आईआर) नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएम-आईआर), जो एक साथ AFM के उच्च संकल्प और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी की रासायनिक मान्यता शक्ति का शोषण करता है, आगे जा सकते हैं और व्यक्ति के संरचनात्मक गुणों की विशेषता को सक्षम कर सकते हैं प्रोटीन समुच्चय, और इस प्रकार एकत्रीकरण तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. चूंकि हमारे द्वारा वर्णन किए जाने वाले दृष्टिकोण को छोटे अणुओं और एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन असेंबली की बातचीत की जांच के लिए भी लागू किया जा सकता है, इसलिए यह निदान या इलाज के लिए नए चिकित्सीय यौगिकों को विकसित करने के लिए मौलिक जानकारी प्रदान कर सकता है तंत्रिकाअपवर्ती विकार.
Introduction
दुनिया भर में 40 लाख से अधिक लोगों को वर्तमान में neurodegenerative विकारों से प्रभावित हैं, जैसे अल्जाइमर (एडी)1 और पार्किंसंस (पीडी)2 रोगों. अधिक आम तौर पर, पचास से अधिक रोगों प्रोटीन misfolding और एकत्रीकरण के साथ आणविक स्तर पर जुड़े रहे हैं, एक प्रक्रिया है कि अघुलनशील फाइब्रिलार प्रोटीन समुच्चय के प्रसार की ओर जाता है, एमिलॉयड जमा के रूप में जाना जाताहै 3, 4. neurodegeneration के आणविक मूल और प्रोटीन के साथ इसके संबंध amyloid गठन करने के लिए अग्रणी प्रोटीन की संरचना परिवर्तन, तथापि, विषमता के उच्च स्तर की वजह से बड़े हिस्से में स्पष्ट नहीं रह, क्षणिक प्रकृति और नैनोस्केल रोगविज्ञान के आयाम4,5.
पिछले कई दशकों में प्रोटीन संरचनाओं की अत्यधिक सफल जांच व्यापक रूप से एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, क्रायो-इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी5सहित थोक तरीकों के उपयोग पर आधारितहै। 6 , 7 , 8 , 9.तकनीकों के इस वर्ग के भीतर, अवरक्त (आईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन8जैसे जैविक प्रणालियों के रासायनिक गुणों को जानने के लिए एक संवेदनशील विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में उभरा है। आईआर विधियों उनके misfolding और एकत्रीकरण के दौरान प्रोटीन माध्यमिक और चतुष्क संरचनात्मक परिवर्तन के परिमाणकी अनुमति देते हैं. इसके अलावा, सूक्ष्म स्तर पर आगे समझने के लिए उनके एकत्रीकरण के दौरान प्रोटीन के जटिल मुक्त ऊर्जा परिदृश्य में शामिल मशीनी विवरण, एक प्रमुख अग्रिम रासायनिक गतिज उपकरणों का विकास किया गया है जटिल करने के लिए विस्तार करने के लिए आत्म-एसेम्बली पथ जिसमें एमिलॉयड फाइब्रिल्स गठन5,6,7,10,11,12शामिल हैं . हालांकि, थोक स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों समाधान में मौजूद प्रजातियों की विषम पहनावा पर केवल औसत जानकारी प्रदान करते हैं या विशिष्ट सूक्ष्म चरणों में शामिल है, इस प्रकार व्यक्ति के biophysical गुणों की जांच प्रतिपादन नैनोस्केल स्तर13,14पर चुनौतीपूर्ण एकत्रित प्रजातियां .
पिछले दशकों में प्रकाश की विवर्तन सीमा से छोटे पैमाने पर प्रचालन की क्षमता वाली अनेक माइक्रोस्कोपी तकनीकें सामने आई हैं। विधियों के इस वर्ग में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तथा परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) शामिल हैं। जबकि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) एक नमूना के दो आयामी (2 डी) छवियों प्रदान करते हैं, AFM एक शक्तिशाली और बहुमुखी तकनीक के रूप में पिछले दशकों में उभरा है तीन आयामी (3 डी) morphologies का अध्ययन करने के लिए, के रूप में साथ ही उप-नानोमीटर संकल्प13,14,15,16,17,18,19के साथ एक नमूने के नैनोमैकेनिकल गुण, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27एएफएम के माध्यम से प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के पीछे तर्क यह है कि यह दृष्टिकोण समाधान13,14,16में उपस्थित अलग-अलग प्रजातियों के आकारिकी की जांच में सक्षम बनाता है, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. विशेष रूप से, समय के एक समारोह के रूप में नमूना की निगरानी करके, AFM नमूना के भीतर प्रजातियों की आकृति विज्ञान के विकास की जांच की अनुमति देता है, जो यह संभव का पालन करें और amyloid गठन के रास्ते कल्पना करने के लिए बनाता है23, 25,38,39,40,41,42. इसके अलावा, AFM इस तरह के पार अनुभागीय ऊंचाइयों और समाधान13,19,30,31 में मौजूद व्यक्तिगत प्रजातियों की लंबाई के रूप में संरचनात्मक मानकोंकेपरिमाणीकरण सक्षम बनाता है ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48.तथापि, एक जैवभौतिक संपदा, जैसे आकारिकी का अध्ययन अक्सर विषमांगी और जटिल जैविक प्रणालियों का अध्ययन करते समय पर्याप्त नहीं होता है। एएफएम, एसईएम या टीईएम इमेजिंग तरीके अकेले नैनोस्केल पर एमिलॉयड समुच्चय की विषमांगी प्रजातियों के रासायनिक गुणों को आसानी से प्रकट नहीं करते हैं।
इस पैमाने पर विषमांगी जैविक नमूनों के विश्लेषण के लिए एक प्रमुख अग्रिम हाल ही में अवरक्त नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी के प्रोटीन एकत्रीकरण के क्षेत्र में विकास और आवेदन के साथ किया गया है (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. इस अभिनव विधि आईआर के रासायनिक विश्लेषण शक्ति के साथ AFM के स्थानिक संकल्प के संयोजन का शोषण ($ 1 $ 10 एनएम)। AFM-IR तकनीक एक आईआर लेजर द्वारा संचालित photothermal प्रेरित अनुनाद प्रभाव की माप पर आधारित है, और AFM टिप द्वारा जांच के तहत नमूने के थर्मल विस्तार की माप पर. नमूना आईआर लेजर द्वारा सीधे ऊपर से या कुल आंतरिक प्रतिबिंब में नीचे से प्रकाशित किया जा सकता है, इसी तरह पारंपरिक अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी24,42,52,53 में के रूप में . आईआर लेजर किलोहर्ट्ज़ (1 डिग्री 1000 kHz) के सैकड़ों के क्रम में विशिष्ट आवृत्तियों के साथ स्पंदित किया जा सकता है और एक विस्तृत वर्णक्रमीय रेंज पर देखते हैं, आम तौर पर के बीच 1000 $3300 सेमी-1. हालांकि लेजर स्रोत $ 30 डिग्री मीटर व्यास के एक क्षेत्र को शामिल किया गया, AFM-IR तकनीक के स्थानिक संकल्प नाममात्र AFM टिप व्यास है, जो प्रणाली के स्थानीय थर्मल विस्तार का पता लगाता है द्वारा निर्धारित किया जाता है. AFM-IR अच्छी तरह से जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है क्योंकि आईआर संकेत उनकी मोटाई के लिए आनुपातिक है 1 $1.5 $m, और जिसके परिणामस्वरूप आईआर स्पेक्ट्रम इसी FTIR संचरण स्पेक्ट्रम के साथ समझौते में आम तौर पर कर रहे हैं13,54 ,55. इस कारण से, स्पेक्ट्रोस्कोपी में विश्लेषण की स्थापित विधियों को आसानी से लागू किया जा सकता है, जैसे रासायनिक बदलाव का अध्ययन, बैंड आकार परिवर्तन और दूसरे डेरिवेटिव विश्लेषण52द्वारा वि-कन्वलन। कुल मिलाकर, आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी की रासायनिक मान्यता शक्ति के साथ AFM के स्थानिक संकल्प के संयोजन, AFM-IR नैनोस्केल पर एक नमूने की आकृतिक, यांत्रिक और रासायनिक गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला के एक साथ अधिग्रहण सक्षम बनाता है.
यहाँ, हम प्रोटीन एकत्रीकरण की प्रक्रिया है कि इन विट्रो फ्लोरोसेंट परख, उच्च संकल्प AFM इमेजिंग और नैनोस्केल AFM-IR के संयोजन का शोषण की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णन. यह संयुक्त दृष्टिकोण पहले से ही प्रोटीन समुच्चय द्वारा गठित व्यक्तिगत सूक्ष्म बूंदों के रासायनिक और संरचनात्मक गुणों का अध्ययन करने में विस्तृत परिणाम प्रदान करने में उत्कृष्ट है, तरल तरल प्रोटीन चरण जुदाई के अध्ययन में, और में नैनोस्केल 23 ,26,38,45,50,53में अलग – अलग एकत्रित प्रजातियों के विषमता और जैवभौतिक गुणों की जांच करना, 56,57.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम मोनोमेरिक प्रोटीन की तैयारी है, जैसे कि चरण 1.1 और 1.2 में वर्णित एजेड 42 समाधान के मामले में। यह एक अत्यधिक शुद्ध, monomeric समाधान से एकत्रीकरण प्रक्रिया आरंभ करने के लिए आवश?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों वित्तीय सहायता के लिए स्विस नेशनल फाउंडेशन (SNF) धन्यवाद (अनुदान संख्या P2ELP2$162116 और P300P2]171219), डार्विन कॉलेज, इरास्मस + वित्तीय सहायता के लिए कार्यक्रम (अनुदान संख्या 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) और इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन प्राप्त हुआ है (FP7/2007-2013) ईआरसी अनुदान PhysProt के माध्यम से (समझौता संख्या 337969), न्यूमैन फाउंडेशन (T.P.J.K.) और The कैम्ब्रिज सेंटर फॉर मिसफोल्डिंग रोग (सी.जी., एम.वी., और टी.पी.जे.के.)।
Materials
| AFM-IR system | Anasys Instruments | nanoIR 2 or 3 | Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode |
| Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3881 | |
| Corning Microplate Aluminium Sealing Tape | Corning | 6570 | |
| Double Sided Adhesive Discs | AGAR Scientific | AGG3347N | |
| FLUOstar Omega | BMG Labtech | 415-101 | Platereader |
| Mica Disc 10mm V1 | AGAR Scientific | AGF7013 | |
| Park NX10 AFM system | Park Systems | N/A | Atomic Force Microscope |
| Platypus Ultra-Flat Gold Chips | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | |
| PPP-NCHR-10 cantilevers | Park Systems | PPP-NCHR-10 | |
| Protein LowBind Tubes, 2.0mL | Eppendorf | 30108132 | |
| Silicon gold coated cantilevers | Anasys Instruments | PR-EX-nIR2 | |
| SPM Specimen Discs 12mm | AGAR Scientific | AGF7001 |
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