Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Francesco Simone Ruggeri; Tomas &#352;neideris; Sean Chia; Michele Vendruscolo; Tuomas  P. J. Knowles

doi:10.3791/60108

JoVE Journal > Biochemistry

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Biochimica

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

Published: September 12, 2019

doi:

10.3791/60108

Francesco Simone Ruggeri, Tomas Šneideris², Sean Chia, Michele Vendruscolo, Tuomas P. J. Knowles³

¹Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry,University of Cambridge, ²Institute of Biotechnology, Life Sciences Center,Vilnius University, ³Cavendish Laboratory, Department of Physics,University of Cambridge

Summary

Wir beschreiben die Anwendung von Infrarot-Nanospektroskopie und hochauflösender Atomkraftmikroskopie, um den Prozess der Protein-Selbstmontage in oligomere Aggregate und Amyloidfibrillen zu visualisieren, die eng mit dem Beginn und der Entwicklung verbunden sind. einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen.

Abstract

Das Phänomen der Proteinfehlfaltung und -aggregation führt zur Bildung hochheterogener Proteinaggregate, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht werden. Insbesondere niedermolekulare Aggregate, Amyloid-Oligomere, haben nachweislich generische zytotoxische Eigenschaften und sind als Neurotoxine in vielen Formen von Demenz involviert. Wir veranschaulichen den Einsatz von Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie (AFM), um die anspruchsvolle Aufgabe der Charakterisierung der morphologischen, strukturellen und chemischen Eigenschaften dieser Aggregate anzugehen, die mit konventionellen strukturellen biophysikalische Methoden aufgrund ihrer Heterogenität und Vergänglichkeit. Scan-Sondenmikroskopie-Ansätze sind nun in der Lage, die Morphologie von Amyloid-Aggregaten mit Sub-Nanometer-Auflösung zu untersuchen. Wir zeigen hier, dass die Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR), die gleichzeitig die hohe Auflösung von AFM und die chemische Erkennungskraft der IR-Spektroskopie ausnutzt, weiter gehen und die Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften einzelner Proteinaggregate und bieten so Einblicke in die Aggregationsmechanismen. Da der von uns beschriebene Ansatz auch auf die Untersuchungen der Wechselwirkungen von Proteinassemblys mit kleinen Molekülen und Antikörpern angewendet werden kann, kann er grundlegende Informationen liefern, um neue therapeutische Verbindungen zur Diagnose oder Behandlung zu entwickeln. neurodegenerative Störungen.

Introduction

Mehr als 40 Millionen Menschen weltweit sind derzeit von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer (AD)¹ und Parkinson (PD)² Krankheiten betroffen. Allgemeiner gesagt, sind mehr als fünfzig Pathologien auf molekularer Ebene mit Proteinfehlfaltung und -aggregation assoziiert, ein Prozess, der zur Proliferation von unlöslichen fibrillaren Proteinaggregaten führt, die als Amyloidablagerungen³ ^{bekannt sind. 4}. Die molekularen Ursprünge der Neurodegeneration und ihre Verbindungen mit Proteinkonformationsveränderungen von Proteinen, die zur Amyloidbildung führen, bleiben jedoch weitgehend unklar, was zum großen Teil auf das hohe Maß an Heterogenität, transikulären Natur und nanoskalige Abmessungen der pathologischen Aggregate⁴^,⁵.

Sehr erfolgreiche Untersuchungen von Proteinstrukturen in den letzten Jahrzehnten basierten weitgehend auf dem Einsatz von Massenmethoden, einschließlich Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie⁵^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹. Innerhalb dieser Klasse von Techniken hat sich die Infrarotspektroskopie (IR) als ein sensibles Analysewerkzeug herausgebildet, um die chemischen Eigenschaften biologischer Systeme wie Proteine⁸zu entwirren. IR-Methoden ermöglichen die Quantifizierung von sekundären und quartären Strukturveränderungen des Proteins während ihrer Fehlfaltung und Aggregation. Um auf mikroskopischer Ebene die mechanistischen Details, die in den komplexen freien Energielandschaften von Proteinen während ihrer Aggregation involviert sind, weiter zu entschlüsseln, war ein großer Fortschritt die Entwicklung chemischer Kinetik-Werkzeuge, die sich auf komplexe Selbstmontagewege einschließlich AmyloidfibrillenBildung⁵^,⁶^,⁷^,¹⁰^,¹¹^,¹². Massenspektroskopische Methoden liefern jedoch nur durchschnittliche Informationen über das heterogene Artenensemble, das in Lösung oder in bestimmten mikroskopischen Schritten vorhanden ist, wodurch die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierte Arten, die auf der Nanoskala anspruchsvoll sind¹³^,¹⁴.

In den letzten Jahrzehnten sind mehrere Mikroskopietechniken mit der Fähigkeit entstanden, auf Skalen zu arbeiten, die kleiner als die Beugungsgrenze des Lichts sind. Diese Methodenklasse umfasst Elektronenmikroskopie (EM) und Atomkraftmikroskopie (AFM). Während Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zweidimensionale (2D) Bilder einer Probe liefern, hat sich AFM in den letzten Jahrzehnten als eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Untersuchung dreidimensionaler (3D) Morphologien sowie die nanomechanischen Eigenschaften einer Probe mit Sub-Nanometer-Auflösung¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ ^, ²⁴ ^, ²⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷. Der Grund für die Untersuchung der Proteinaggregation über AFM ist, dass dieser Ansatz die Untersuchung der Morphologie einzelner Arten in Lösung¹³^,¹⁴^,¹⁶ermöglicht. ¹⁷^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²⁵^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^, ³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷. Insbesondere durch die Überwachung der Probe als Funktion der Zeit, AFM ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung der Morphologie der Art innerhalb der Probe, die es ermöglicht, zu folgen und visualisieren die Wege der Amyloidbildung²³^, ²⁵^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Darüber hinaus ermöglicht AFM die Quantifizierung von Strukturparametern wie Querschnittshöhen und -längen der einzelnen Arten in Lösung¹³^,¹⁹^,³⁰^,³¹ ^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,⁴⁰^,⁴³^, ⁴⁴ ^, ⁴⁵ ^, ⁴⁶ ^, ⁴⁷ ^, ⁴⁸. Die Untersuchung einer einzigen biophysikalischen Eigenschaft, wie z. B. der Morphologie, reicht jedoch bei der Untersuchung heterogener und komplexer biologischer Systeme oft nicht aus. AFM-, SEM- oder TEM-Bildgebungsverfahren allein zeigen nicht ohne weiteres die chemischen Eigenschaften heterogener Arten von Amyloid-Aggregaten im Nanomaßstab.

Ein großer Fortschritt für die Analyse heterogener biologischer Proben in diesem Maßstab wurde in jüngster Zeit mit der Entwicklung und Anwendung auf dem Gebiet der Proteinaggregation der Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR)²⁴^,²⁶, ³⁸^,⁴²^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵². Diese innovative Methode nutzt die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM (1,10 nm) mit der chemischen Analyseleistung von IR. Die AFM-IR-Technik basiert auf der Messung des photothermischen induzierten Resonanzeffekts, der von einem IR-Laser angetrieben wird, und auf der Messung der thermischen Ausdehnung der Probe, die von der AFM-Spitze untersucht wird. Die Probe kann mit dem IR-Laser direkt von oben oder von unten in der gesamten inneren Reflexion beleuchtet werden, ähnlich wie bei der herkömmlichen Infrarotspektroskopie²⁴^,⁴²^,⁵²^,⁵³. Der IR-Laser kann mit typischen Frequenzen in der Größenordnung von Hunderten von Kilohertz (1×1000 kHz) gepulst und über einen weiten Spektralbereich abgestimmt werden, typischerweise zwischen 1000 und 3300 cm^-1. Obwohl die Laserquelle eine Fläche von 30 m Durchmesser abdeckt, wird die räumliche Auflösung der AFM-IR-Technik nominell durch den AFM-Spitzendurchmesser bestimmt, der die lokale Wärmeausdehnung des Systems erkennt. AFM-IR eignet sich gut für die Untersuchung biologischer Proben, da das IR-Signal proportional zu ihrer Dicke bis zu 1,5 m ist und die resultierenden IR-Spektren im Allgemeinen mit den entsprechenden FTIR-Übertragungsspektren¹³^,54 übereinstimmen. ^,⁵⁵. Aus diesem Grund können etablierte Analysemethoden in der Spektroskopie problemlos angewendet werden, wie z. B. die Untersuchung chemischer Verschiebungen, Bandformänderung und De-Konvolution durch zweite Derivateanalyse⁵². Insgesamt ermöglicht AFM-IR durch die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM mit der chemischen Erkennungskraft der IR-Spektroskopie die gleichzeitige Erfassung einer vielzahl morphologischer, mechanischer und chemischer Eigenschaften einer Probe im Nanomaßstab.

Hier illustrieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung des Prozesses der Proteinaggregation, das die Kombination von In-vitro-Fluoreszenz-Assays, hochauflösender AFM-Bildgebung und nanoskaliger AFM-IR nutzt. Dieser kombinierte Ansatz hat sich bereits durch detaillierte Ergebnisse bei der Untersuchung der chemischen und strukturellen Eigenschaften einzelner Mikrotröpfchen, die durch Proteinaggregate gebildet werden, bei der Untersuchung der Flüssigkeits-Flüssig-Proteinphasentrennung und in Untersuchung der Heterogenität und der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierter Arten im Nanomaßstab²³^,²⁶^,³⁸^,⁴⁵^,⁵⁰^,⁵³^, ⁵⁶^,⁵⁷.

Protocol

1. Aggregations-Assays auf Fluoreszenzplattenlesern HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie die Aggregation von Proteinen oder Peptiden durch chemische Kinetik untersucht werden kann. Insbesondere beschreibt es ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung der Aggregation des Peptids A-42, das am Beginn und fortschreitender Alzheimer-Krankheit beteiligt ist58,59. Ein ähnliches Protokoll kann angepasst und ange…

Representative Results

Abbildung 1zeigt einen repräsentativen Zeitverlauf der A-42-Aggregation, gemessen anhand des ThT-Fluoreszenz-Assays. Der Aggregationsprozess ist häufig durch eine sigmoidale Kurve gekennzeichnet, bei der zunächst eine Verzögerungsphase beobachtet wird, gefolgt von einer steilen Wachstumsphase, bevor die Kurve ein Plateau erreicht, wenn ein Gleichgewichts-Stabilitätszustand erreicht wird6,7 , 58…

Discussion

Der erste kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Herstellung monomerer Proteine, wie im Fall der in den Schritten 1.1 und 1.2 beschriebenen Lösung A-42. Es ist wichtig, den Aggregationsprozess aus einer hochreinen, monomeren Lösung zu initiieren, da das Vorhandensein von oligomeren oder aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Aggregationskinetik führen kann⁵⁸, und Artefakte im AFM induzieren kann. (z. B. fibrillare Arten werden in den Anfangsstadien der Aggregation …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der Schweizerischen Nationalstiftung für Wissenschaft (SNF) für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer P2ELP2_162116 und P300P2_171219), dem Darwin College, Erasmus+ Programm für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) und Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7/2007-2013) über das ERC-Stipendium PhysProt (Vereinbarung nr. 337969), die Newman Foundation (T.P.J.K.) und The The Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. und T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system	Anasys Instruments	nanoIR 2 or 3	Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape	Corning	6570
Double Sided Adhesive Discs	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	Platereader
Mica Disc 10mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 AFM system	Park Systems	N/A	Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers	Park Systems	PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL	Eppendorf	30108132
Silicon gold coated cantilevers	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm	AGAR Scientific	AGF7001

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