Neutrofile ekstrellulære fælder (NETs) er tredimensionale strukturer genereret af stimulerede neutrofile granulocytter. Det er i de seneste år blevet klart, at NETs er involveret i en lang række sygdomme. Påvisning af garn i væv kan have diagnostisk relevans, så der kræves standardiserede protokoller til mærkning af netto komponenter.
Neutrofile granulocytter, også kaldet polymorphonukleare leukocytter (PMN) på grund af deres lobuleret kerne, er den mest udbredte type leukocytter. De modnes i knoglemarven og frigives i det perifere blod, hvor de cirkulerer i ca. 6 − 8 timer; men i væv, de kan overleve i dagevis. Ved diapedese gennem endothelium, de forlader blodet, indtaste væv, og migrere mod stedet for en infektion efter kemoterapi gradienter. Neutrofiler kan bekæmpe invaderende mikroorganismer ved fagocytose, degranulering og generering af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs). Denne protokol vil bidrage til at afsløre garn i paraffin-indlejret væv. NETs er resultatet af en proces kaldet NETosis, som fører til frigivelse af nukleare, granulære og cytoplasmatiske komponenter enten fra levende (Vital Netose) eller døende (Suicidal NETosis) neutrofiler. In vitro, NETs danner Sky-lignende strukturer, som optager et rum flere gange større end de celler, hvorfra de nedstammer. Rygraden af garn er kromatin, som et udvalg af proteiner og peptider stammer fra granulat og cytoplasma er bundet. Derved opretholdes en høj lokal koncentration af giftige forbindelser, således at NETs kan indfange og inaktivere en række patogener, herunder bakterier, svampe, vira og parasitter, mens udbredelsen af de meget aktive NETKOMPONENTER, der fører til skader i tilstødende væv er begrænset. Ikke desto mindre er det i de seneste år blevet tydeligt, at net, hvis de produceres i overflod eller ryddet utilstrækkeligt, har patologisk potentiale, der spænder fra autoimmune sygdomme til kræft. Påvisning af garn i vævsprøver kan således have diagnostisk betydning, og påvisning af net i et sygt væv kan påvirke behandlingen af patienter. Da paraffin-indlejrede vævsprøver er det Standardpræparat, der anvendes til patologisk analyse, blev det forsøgt at etablere en protokol for fluorescerende farvning af netto komponenter i paraffin-indlejret væv ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer.
Neutrofile ekstrellulære fælder (NETs) har en kompleks tredimensionel struktur. Høj opløsning scanning-elektron mikroskopisk analyse afslørede, at de består af glatte fibre med en diameter på 15 − 20 Nm (kromatin) besat med glokulære domæner af > 25 Nm, som formentlig består af et sortiment af omkring 30 granulære og cytoplasmatiske proteiner og peptider1,2. Når net genereres in vitro fra isolerede neutrofiler, kan det identificeres ved farvning af to eller flere af deres bestanddele ved immunofluorescens (f. eks. histoner og neutrofile elastase [NE]). I ustimulerede polymorphonukleare leukocytter (PMN) er histoner udelukkende placeret i kernen, mens NE er indeholdt i granulat. Under netosis, ne kommer ind i kernen, hvor det behandler histoner3,4. NETs er karakteriseret ved samlokalisering af komponenter, som er klart adskilt i ustimulerede neutrofiler. Da der i øjeblikket ikke findes antistoffer, der udelukkende detekterer specifikke netto epitoper (dvs. ikke reagerer med naive neutrofiler), er påvisning af samlokalisering af neutrofilproteiner i net den eneste måde at identificere garn på.
I væv kan garn næppe påvises ved konventionelle histologiske pletter (f. eks. ved farvning med hematoxylin/eosin [H & E], som skildrer net som en diffus bleg blålig skær). Kun når der er meget rigelige, kan garn tydeligt skelnes med H & E farvning, såsom i trombi5. Da garn er diffus i sig som sådan, skal vævs strukturen bevares optimalt, så Cryo-præparater, der er tilbøjelige til at fremkalde fryse artefakter, er suboptimale til analyse af garn i væv. I stedet, formaldehyd fiksering og paraffin indlejring har vist sig at bevare netto struktur i væv godt2. (Immuno-) histologisk inspektion af sektioner af paraffin-indlejret væv er standardmetode til patologisk analyse. Da væv i paraffinblokke bevares, selv ved stuetemperatur (RT), kan vævsprøver fra det daglige diagnostiske arbejde sammenlignes med prøver, der er blevet udarbejdet år siden, med spørgsmål og teknikker, der for nylig er opstået. Garn i væv er ikke blevet påvist indtil for nylig, og detaljeret analyse af netto dannelse og fjernelse i løbet af sygdomme kan føre til ny indsigt i patogenesen. Brugen af paraffin-indlejret væv har den uvurderlige fordel at tillade analyse af arkiverings materiale og til at foretage retrospektive undersøgelser6. Unægtelig, disse fordele kommer til en pris. Før det integreres i paraffin, skal vævet være formaldehyd-fast, dehydreret og opvarmet over 50 °C. Disse procedurer inducerer vævs autofluorescens samt epitop maskering.
For at begrænse fikserings artefakter bør fikserings tiden holdes på et minimum, så størrelsen af vævsprøverne må ikke overskride et område på 20 mm x 30 mm med ~ 3 mm tykkelse. Prøver af denne størrelse er helt fikseret efter natten inkubation ved RT i formaldehyd, ideelt efterfulgt af direkte dehydrering og paraffin indlejring. Alternativt kan faste prøver opbevares i 1 eller 2 dage i buffer. For immunofluorescens undersøgelser skal fikseret være frisk fremstillet af PARAFORMALDEHYD opløst i en passende buffer (f. eks. fosfat-bufferet saltvand [PBS] eller Tris-bufferet saltvand [TBS]). Under fixativ tilberedning skal temperaturen holdes under 60 °C for at forhindre dannelse af myresyre. Formalin, som er en standard fixativ for patologi, bør ikke anvendes, da det indeholder methanol, andre aldehyder, ketoner og myresyre. Disse urenheder fører til øget epitop maskering og signifikant vævs autofluorescens.
For vellykket immunolabelling, epitop maskering skal være vendt i en proces kaldet antigen hentning. Vævs sektioner opvarmes i en passende buffer, som menes at bryde methylenbroer, så epitoper bliver tilgængelige for antistofferne7. Til påvisning af garn foretrækkes varme induceret epitop-hentning (HIER) til andre metoder, såsom anvendelse af Proteolytiske enzymer. Rutinemæssigt udføres immunolmærkning af paraffin sektioner med et enkelt antistof efterfulgt af et peroxidase-mærket sekundært antistof, som detekteres med et bund dannende substrat. Sammenlignet med immunofluorescens, enzym-baserede detekteringsmetoder har en lavere rumlig opløsning på grund af diffusion af substratet bundfald, og generelt, samtidig påvisning af mere end ét antigen er begrænset6.
Som i øjeblikket ingen antistoffer eksisterer, der udelukkende binder sig til NETs, denne protokol bruges til at mærke to proteiner, Histon 2b, som er nuklear, og neutrofile elastase, som er lokaliseret i granulat. I ustimulerede neutrofiler adskilles disse proteiner, men de er lokaliseret i neutrofiler, der gennemgår Netose og i net. Samtidig påvisning af to antigener kan opnås med to primære antistoffer, der er rejst i forskellige værter og to artsspecifikke sekundære antistoffer mærket med forskellige fluorochromer. Denne rapport er en standardisering af vores tidligere offentliggjorte protokol8 og bruger en kombination af to kommercielt tilgængelige antistoffer, der PÅLIDELIGT pletter netto komponenter i paraffin-indlejret væv, både frisk og arkiverings, af human og murine oprindelse.
Med stigende bevidsthed om rollen af NETs under patogenesen9, deres påvisning i væv fra patienter eller forsøgsdyr vinder stigende betydning. Paraffin-indlejrede vævsprøver har en række fordele sammenlignet med andre vævs præparater (f. eks. dele af kryopræserverede prøver). Vævs konservering i paraffin-indlejrede prøver er klart overlegne, og når indlejret, prøverne bevares i årtier, muliggør tilbage undersøgelser. Til påvisning af garn, som er filigran strukturer, god prøve bevaring er en forudsætning udelukker brugen af kryopræserverede materiale, som er tilbøjelige til vævsskade på grund af is krystaldannelse, der kan give anledning til artefakter morfologisk ligner Net.
For at opnå optimal konservering bør væv fra forsøgsdyr fastsættes kort efter døden, ideelt set ved perfusion, for at undgå autolyse. Som fixative, frisk tilberedte eller frisk optøede opløsninger af PARAFORMALDEHYD i en passende buffer som TBS eller PBS malm optimalt. Dette er kemisk defineret i modsætning til formalin præparater, der anvendes til standard histologi, og inducerer mindre vævs autofluorescens. I modsætning hertil er humant væv ofte ikke fastgjort direkte efter excision, og som fikseringsmiddel anvendes normalt en 10% fortynding af formalin, som indeholder 10% til 15% methanol som stabilisator for at forhindre polymerisering, samt myresyre, andre aldehyder og ketoner . Ofte, vævet er lagret i denne fiksativ for længere mængder af tid, før indlejring. Resultatet kan være autolyse (afhængigt af tiden mellem excision og fiksering), og overdreven dannelse af methylen broer på grund af over fiksering. Formaldehyd fiksering inducerer ændringer i den tertiære struktur af proteiner ved dannelse af intra-og Inter-molekylære methylen broer10. Ikke-proteinholdige celle komponenter som nukleinsyrer, kulhydrater og lipider er ikke fastgjort direkte, men immobiliseret i det tredimensionale proteinnetværk. For at opnå en vellykket mærkning, skal methylen obligationer brydes for at afsløre epitoper i processen med antigen hentning. Dette opnås ved opvarmning af vævs sektioner monteret på mikroskop glider i en passende varme-induceret antigen hentning buffer (HIER buffer)11. Vores tidligere undersøgelse analyserede indflydelsen af pH og temperatur af HIER buffere på påvisning af netto komponenter i paraffinized væv, og det blev konstateret, at vellykket væv forbehandling for en komponent ofte er suboptimal for en anden komponent8.
I mellemtiden har det været konstateret, at opvarmning af vævet til 70 °C i HIER buffer ved en pH-værdi på 9 er et godt kompromis for mange netto komponenter og vil bevare god vævs bevaring, som ofte kompromitteres ved højere temperaturer. Det foreslås at bruge den tid, der er angivet som udgangspunkt, men især med arkiverings enheder af ukendte fikserings parametre, kan farvnings intensiteten være utilfredsstillende. I dette tilfælde kan forlængelse af eller højere temperatur under hentningproceduren forbedre farvnings effektiviteten. Dette kan også påvirke Histon 2b-farvning af det igy-antistof, der anvendes i vores protokol. Som vist i figur 1, dekomprimeret kromatin kan findes i neutrofiler undergår netose samt i net pletter meget stærkere med dette antistof sammenlignet med kromatin i hvilende neutrofiler. Dette er sandsynligvis på grund af begrænset adgang til 180 kDa igy molekyle til kompakte kerner og kan afvige efter øget epitop opsving. Dette kan forstærke bindende effektivitet selv i områder med kondenseret kromatin, hvilket vil resultere i stærkere fluorescens i normale kerner af neutrofiler og andre celler. Forskellen i farvnings effektivitet mellem neutrofiler, der gennemgår Netose og ikke-stimulerede neutrofiler, kan være mindre udtalt end afbildet i figur 1. Områder med netto dannelse vil stadig blive identificeret ved samlokalisering af NE, H2B og DNA.
Fikserings proceduren kan også fremkalde en betydelig autofluorescens af vævet, hovedsageligt i den blålige/greeniske del af spektret. Det er vigtigt at undgå det meste af denne autofluorescens ved hjælp af passende smalle båndpas fluorescens filtersæt (Wide-felt) eller detektor indstillinger (confocal), der svarer til emissions maksimum af vha, der anvendes med blå excitation, f. eks Cy2, alexafluor 488. i ekstreme tilfælde af autofluorescens bør den blåagtige/greeniske del af spektret undgås. I stedet kan fluorescens signaler påvises lettere i den fjerneste røde del af spektret (f. eks. sekundære antistoffer koblet til CY 5 eller alexafluor 635), men dette kræver og sort/hvide kameraer eller konfokale mikroskoper. Da det menneskelige øje er temmelig ufølsom ud over 600 nm, kan langt røde fluorescens signaler næppe detekteres ved hjælp af okularer. Under alle omstændigheder er det vigtigt at anvende negative kontroller (f. eks. ikke-immunsera/isotype kontrol i stedet for primære antistoffer eller udelade primære antistoffer) for at bestemme passende eksponeringstider eller detektor indstillinger.
Vævs sektioner på 1 − 2 μm kan analyseres med brede felt mikroskoper med 10x eller 20x mål. Disse linser giver en stor fokal dybde, så (næsten) hele vævs sektionen vil være i fokus. Dette kan bruges til hurtigt at scanne vævs sektioner for områder med netto dannelse, hvis de er tilstrækkeligt store (som i figur 1). Samlokaliseringen af de grønne (NE), røde (H2B) og blå (DNA) kanaler resulterer i en hvid farvning, der indikerer områder med netto dannelse (figur 1G). For højere forstørrelser er det nødvendigt med konfokale eller bred felt mikroskoper med dekoncentrering. Figur 2 viser detaljer om det humane blindtarms præparat, der også anvendes til figur 1. I figur 2alokaliserer ne til små prikker (granulat), men en stor del er ekstracellulære, ofte danner striber, der overlapper med H2B (figur 2b) og DNA (figur 2c). Denne samlokalisering resulterer i et hvidlig overlay, der indikerer net (figur 2D). Et meget lignende mønster kan findes i lunge delen af en mus inficeret med M. tuberkulose (figur 3).
Modellerne præsenteres her er karakteriseret ved områder med en høj grad af netto dannelse, som kan identificeres selv ved lav forstørrelse. Afhængigt af vævs tætheden og den respektive stimulus kan netto dannelsen være langt mindre udtalt, ned til netto dannelsen af små grupper af neutrofiler (for eksempel i myocarditis, se en tidligere publikation12). Det menes, at denne protokol vil bidrage til at fremme forskningen i net i væv og forhåbentlig hjælpe med at fjerne ikke-anerkendte nettenes rolle i dannelsen eller forebyggelsen af sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har intet at afsløre.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |