Målet med detta protokoll är att etablera en 3D in vitro-modell för att studera differentiering av cancerassocierade fibroblaster (CAFs) i en tumör bulk-liknande miljö, som kan åtgärdas i olika analyssystem, såsom immunofluorescens, transkriptionella analys och livs cell avbildning.
Att definiera den ideala modellen för en in vitro-studie är viktigt, främst om man studerar fysiologiska processer såsom differentiering av celler. I tumören stroma, värd fibroblaster stimuleras av cancerceller att differentiera. Sålunda, de förvärvar en fenotyp som bidrar till tumören mikromiljö och stöder tumör progression. Genom att använda sfäroid-modellen har vi inrättat ett sådant 3D in vitro-modellsystem, där vi analyserade rollen som laminin-332 och dess receptorintegrin α3β1 i denna differentierings process. Detta sfäroid modellsystem inte bara återger tumören mikromiljö villkor på ett mer exakt sätt, men också är en mycket mångsidig modell eftersom det tillåter olika nedströms studier, såsom Immunofluorescerande färgning av både intra-och extracellulära markörer, samt deponerade extracellulära matrix proteiner. Dessutom kan transkriptionella analyser av qPCR, flödescytometri och cellulär invasion studeras med denna modell. Här beskriver vi ett protokoll av en sfäroid modell för att bedöma rollen av Cafs integrin α3β1 och dess ectopically deponeras ligand, laminin-332, i differentiering och stödja invasionen av cancer i bukspottskörteln celler.
Tumören mikromiljö är en mycket komplex nisch och oerhört viktigt för underhåll och progression av tumörcellerna1. Det bildas inte bara av cancerceller utan också av stromacellstumörer fibroblaster. Tumörcellerna är omgivna av en stroma som är specifik och skiljer sig från stroma av normala vävnader2. Laminin-332 är en extracellulär matrix protein ectopically uttrycks i stroma av olika tumörer, såsom i bukspottskörteln adenocarcinom3. Dessutom, den biokemiska sammansättningen av ECM och även dess biofysiska egenskaper, såsom stelhet och spänningar, förändring inom tumören bulk4. Denna tumör stroma, eller “reaktiv stroma”, orsakas av en anpassning av fibroblaster till angränsande cancerceller och genom rekrytering av andra mycket viktiga aktörer som utvecklar en gynnsam och stödjande miljö för tumör progression. Differentieringen av stromacellstumörer fibroblaster resulterar i cancerassocierade fibroblaster (CAF). Dessa celler kan identifieras med hjälp av olika markörer såsom α-glatt mus kula tal aktin (αsma)5 eller neural/Glial antigen 2 (NG2)6.
Den mest lämpade in vitro -modellen för att recapitulate tumören mikromiljö (TME) med Cafs är svårt att välja. Metoden för att efterlikna de fysiologiska parametrarna för TME på ett kostnadseffektivt och reproducerbart sätt måste övervägas för ett sådant modellsystem. Inom TME förekommer olika processer, såsom spridning, differentiering, migration och invasion av de olika celltyperna. Dessa cellulära processer kan utföras individuellt med olika metoder. Emellertid, experimentella förhållanden måste överväga cellulära interaktioner med tumören stroma ECM, eftersom styvheten i underlaget påverkar CAF differentierings processen. R.G. Wells kommenterade effekterna av mat ris stelhet på cellens beteende och betonade att cytoskelett organisation och differentiering status observerats i in vitro odlade celler kan vara artefakto7. Olika stimuli verkar vara inblandade i CAF differentiering, inklusive mekanisk spänning5,7. För att undvika detta kan 2D mjuka substrat vara möjliga metoder för differentiering studier, eftersom de kringgår problemet med den stela kulturen skålen plast. En mjuk 2D-yta, som fibroblaster kan odlas, kan vara kollagen-I belagda polyakrylamidgeler, varvid gel stelhet kan manipuleras genom koncentrationen av polyakrylamid och gel Cross-Linker. Vidhäftning och bildandet av αSMA-rika stress fibrer förstärks i fibroblaster tillsammans med gel styvhet8. Dessa resultat betonar vikten av mjuka substrat ställningar för mer fysiologiska in vitro-differentieringsmodeller. Men i våra händer var experimentell reproducerbarhet och avbildning av dessa geler utmanande. För att övervinna dessa brister, bytte vi 2D mjuka substrat system för en 3D sfäroid modell för differentiering och invasion studier. Denna modell är mer kliniskt relevant och liknar en in vitro-Organoid, recapitulates in vivo cell-cell interaktioner, ECM produktion och deposition, samt cell Behavior9.
Spheroids bildas när celler saknar ett substrat att hålla sig till. När cellerna lämnas utan en limyta, de aggregat för att bilda en mer eller mindre sfärisk struktur. Om sfäoiderna består av en typ av cell, de kallas homospheroids; om de består av två eller flera olika celltyper de bildar heterospheroids.
Bland de olika metoderna för sfäroid beredning, utför vi protokollet med icke-adherent rund botten 96-bra tallrikar. Det är mycket effektivt med hänsyn till kostnaderna. Här producerar vi både homospheroids av fibroblaster, CAF eller Cafs saknar integrin α3 subenhet att undersöka differentierings processen och heterospheroids av Cafs eller integrin α3 Ko Cafs och bukspottskörteln kanal cancerceller (ASPC-i och Panc-i) för att studera invasionen i den omgivande matrisen.
Syftet med dessa studier var att använda primära CAFs isolerade från mänskliga pankreascancer biopsier. Emellertid, biopsier att få cellerna är knappa och av denna anledning, CAFs används i dessa studier har förevigat med hjälp av lentivirus som innehåller HTERT. De kallas iCAFs, och deras normala motsvarigheter, primära mänskliga bukspottskörteln fibroblaster, kallas iNFs. Den mänskliga bukspottskörteln fibroblaster och bukspottskörteln kanal cancerceller, AsPC-I och PANC-I, är kommersiellt tillgängliga.
Detta protokoll användes för att studera effekten av laminin-332-integrin interaktion i CAF differentiering process. För att bevisa specificitet av denna interaktion och dess funktion, inhibitorföreningar användes: BM2, en monoklonal antikropp som blockerar integrin bindningsstället laminin-332 α3 Chain10, eller lebein 1, en ormgift härledd förening som blockerar lamininbindande integriner α3β1, α6β1 och α7β111,12.
För invasionen analysen, celler hade omvandlas med lentivirus som innehåller cDNA kodning antingen mCherry (iCAFs och integrin α3 KO iCAFs) eller GFP (AsPC-i och PANC-I) för att skilja de olika celltyper i heterospheroids. Transduktion av cellerna för att föreviga dem och/eller att märka dem med fluorescerande protein (mCherry och GFP) uttryck beskrivs i en tidigare studie13, som bör konsulteras för ytterligare information.
Att utveckla en lämplig in vitro-modell för att studera CAF differentiering är en utmanande uppgift. Efter att ha anställts olika metoder, drog vi slutsatsen att en 3D sfäroid modell är den mer praktiska, fysiologiska och kliniskt relevanta modellen, där samspelet mellan pankreascancer celler med förevigade Cafs kan studeras. Denna modell förhindrade spontan differentiering av fibroblaster, på grund av artesakliga stressfaktorer såsom stelhet i cellkulturen plast, åtminstone i kortsiktiga odlingsförhållande…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Barbara Schedding hjälp med att förbereda BM2 och lebein-1. Vi erkänner Àgnes Noel för att dela sin expertis i sfäroid analyser. Vi tackar Sonja Schelhaas och Michael Schäfers för deras hjälp med att hantera lentiviral transfektion under S2 villkor. Vi erkänner Sabine von Rüdens assistent i förbereda CAFs från cancer i bukspottskörteln vävnad.
Den forskning som leder till dessa resultat har fått bidrag från People-programmet (Marie Curie Actions) i Europeiska unionens sjunde ramprogram FP7/2007-2013/enligt REA-överenskommelsen n ◦ (316610) till J.A.E. Dessutom stöddes J.A.E. och A.C.M.C. finansiellt av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inom The cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Detta projekt stöddes också av Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 till J.A.E.).
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
Dnase I | Roche | 10104159001 | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
Incubator | Heraeus | B6060 | |
Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |