Direkte levering af præmonterede Cas9/guide RNA ribonucleoprotein komplekser er et hurtigt og effektivt middel til genomredigering i hæmatopoietiske celler. Her bruger vi denne tilgang til at slette en RUNX1 intronic lyddæmper og undersøge de transkriptionelle svar i OCI-AML3 leukæmiceller.
Hovedparten af det humane genom (~ 98%) består af ikke-kodnings sekvenser. CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-kodning af DNA-sekvenser, der indeholder bindingssteder for transkriptionelle regulatorer til at moduere genekspression. Ændringer af CREs har været impliceret i forskellige sygdomme, herunder kræft. Mens initiativtagere og smagsforstærkere har været den primære CREs for at studere genforordning, er meget lidt kendt om rollen som lyddæmper, som er en anden type af CRE, der formidler gen undertrykkelse. Crispr/Cas9, der oprindeligt blev identificeret som et adaptivt Immunitets system i prokaryoter, er blevet udnyttet til at være et effektivt værktøj til eukaryote genomredigering. Her præsenterer vi brugen af denne teknik til at slette en intronic lyddæmper i human RUNX1 genet og undersøge virkningerne på genekspression i OCI-AML3 leukæmiceller. Vores tilgang er afhængig af elektroporation-medieret levering af to præmonterede Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) komplekser til at skabe to dobbelt-streng pauser (DSBs), der flankerer lyddæmperen. Sletninger kan let screenes ved fragment analyse. Udtryks analyser af forskellige mRNAs transskriberet fra alternative promotorer hjælper med at evaluere promotor-afhængige effekter. Denne strategi kan bruges til at studere andre CREs og er særligt velegnet til hæmatopoietiske celler, som ofte er svære at transficere med plasmid-baserede metoder. Brugen af en plasmid-og virusfri strategi giver mulighed for enkle og hurtige vurderinger af genregulerings funktioner.
CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-kodning af DNA-sekvenser, der indeholder bindingssteder for transkriptionelle regulatorer til kontrol af genekspression1,2. Disse elementer er typisk 100 til 1.000 basepar (BP) Long. Promotorer og smagsforstærkere er de to mest karakteriserede typer af CREs. Initiativtagerne er til stede i umiddelbar nærhed af transskription start sites og udgør den grundlæggende enhed af transskription. Mange gener har mere end én promotor, og deres alternative anvendelse bidrager til transkriptomer mangfoldighed og vævs specificitet3,4. På den anden side, smagsforstærkere aktivere transskription og kan være placeret opstrøms, downstream eller inden for introns af målgener. Smagsforstærkere kan handle fra langt afstand (over en megabase) og uafhængig af orientering1,2. CREs omfatter også lyddæmpere og isolatorer5,6. Førstnævnte handlinger er i modsætning til at frem mere til at hæmme genekspression ved binding til transkriptionelle repressorer, mens sidstnævnte partitioner genomet i diskrete topologisk domæner til at isolere gener fra andre CREs fra tilstødende domæner. Disse elementer handler i samspil med hinanden gennem kort-og/eller langtrækkende kromatin interaktioner og er organiseret i regulatoriske hubs til direkte korrekt spatiotemporale gen udtryk. Nylige fremskridt i sekvensering af High gennemløb har accelereret identifikationen og den funktionelle Annotation af mange CREs, der i høj grad har lettet vores forståelse af de transkriptionelle netværk, der dikterer Lineage-specifikke gen udtryk i forskellige celle-og vævstyper7,8,9,10,11,12.
I betragtning af CREs ‘ grundlæggende rolle i reguleringen af transkriptionen kan deres ændringer føre til afvigende genekspression. Det har vist sig, at CREs ofte forstyrres af genetiske og epigenetiske forandringer i forskellige typer af kræft i mennesker, hvilket bidrager til tumor initiering, progression og aggressivitet13,14. Desuden er CRE-binding faktorer ofte muteret og/eller misexpresses i forskellige kræfttyper, yderligere at fremhæve betydningen af CRE-deregulering i oncogenesis15. CREs kan også påvirkes af strukturelle afvigelser, som eksemplificeret ved hyppige kromosomale rekonstruktioner af immunglobulin Heavy (IgH) gene forstærker, der resulterer i unormal aktivering af de tilstødende onkogener i B-celle-lymfomer16. I akut myeloid leukæmi (AML), repositionering af en enkelt forstærker ved kromosom 3Q rearrangementerne forårsager samtidig GATA2 downregulation og EVI1 aktivering, som potentielt kan målrettes af bet hæmning af forstærker funktioner 17. for nylig karakteriserede vi en ny kromosomal translokation, der involverer forstyrrelse af en RUNX1 intronic lyddæmper, som kan bidrage til AML-progression i en pædiatrisk patient18. Således, decifrere den ikke-kodning kræft genomet giver frugtbare muligheder for at belyse sygdoms patogenese, biomarkør opdagelse og terapeutiske interventioner, som i sidste ende forbedre patientens resultater.
Crispr/Cas9 nuclease pathway, der oprindeligt blev identificeret som et adaptivt immunsystem i prokaryotiske celler, er blevet udnyttet som et hurtigt og omkostningseffektivt middel til websteds specifik genomredigering i levende celler og organismer19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9-systemet involverer to hovedkomponenter: gRNA og Streptococcus pyogenes-afledt Cas9 nuclease. GRNA indeholder en specifik sekvens kaldet protospacer, der genkender målområdet og dirigerer Cas9 til redigering. GRNA består af to dele: CRISPR RNA (crRNA), typisk en 20-Mer nukleotidsekvens, der supplerer måldna, og en Trans-aktivering af crRNA (tracrRNA), som fungerer som en bindende stilladset for nukleasen. En protospacer tilstødende motiv (PAM) (5 ‘-NGG) umiddelbart støder op til målet site er påkrævet for Cas9 spaltning og kavaler plads er placeret 3 nucleotider opstrøms for PAM. CRISPR/Cas9-medieret genredigering udføres almindeligvis ved transfficerende celler med en plasmid, der koder Cas9 og den klonede gRNA23. Men denne fremgangsmåde er udfordrende for hæmatopoietiske celler, som ofte er svære at transficere og kræver langvarige virus-baserede transduktionsmetoder. En alternativ tilgang er direkte cellulær levering af præmonterede Cas9/gRNA RNP komplekser24. En fælles metode til RNP levering er elektro poration, som genererer midlertidige porer i cellemembranen, således at indrejse af RNP komplekser i cellerne25,26. Fordelene ved denne tilgang omfatter brugervenlighed, reduceret off-Target effekter og stabilitet af RNP komplekser. Her beskriver vi en protokol for at bruge RNP-leveringsmetoden til at undersøge den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic lyddæmper i OCI-AML3 leukæmi Cell line18, som blev etableret fra det perifere blod af en AML-patient diagnosticeret med den fransk-amerikanske-britiske M4 under type27. Protokollen omfatter design af crRNA, forberedelse af RNP komplekser, elektroporation samt screening og efterfølgende karakterisering af de ønskede kloner.
Crispr/Cas9-systemet er blevet anvendt i en lang række genomredigerings applikationer såsom gen knockout og Knock-in Studies35,36, transkriptional regulation37,38, genteknologi af forskellige modelorganismer39,40,41,42,43,44 og genterapi45,46. Her demonstrerer vi brugen af CRISPR/Cas9 for at undersøge de funktionelle konsekvenser af at slette en intronic lyddæmper på RUNX1 genet. Leveringen af CRISPR-komponenterne i vores tilgang var ikke afhængig af plasmid-DNA, kloning af gRNA eller virus, men elektroporation af præmonterede Cas9/gRNA RNP-komplekser. Det er blevet påvist, at anvendelsen af eksogen DNA kan forbindes med uønsket integration af fremmede vektor sekvenser i værts genomet, øget toksicitet og lav virkningsgrad25,47,48, hvorimod virus transduktionsmetoder er tidskrævende. Desuden, langvarig ekspression af Cas9 fra plasmid DNA kan forøge off-Target effekter48. Tværtimod er den direkte RNP-baserede leveringsmetode blevet etableret som den foretrukne metode, da den er hurtig og ligetil med forbedret redigerings effektivitet, selektivitet og cellelevedygtighed. Faktisk, en række forskellige metoder såsom lipofection49,50, elektro poration25,51, nanopartikler52, celle-penetratering peptider53, iTop54 og triamf 55 er udviklet til effektiv crispr/Cas9-levering i forskellige celletyper samt dyre-og plantearter24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. da ikke-kodning DNA-sekvenser er hotspots af genetiske variationer64, kontrollere tilstedeværelsen af fælles SNPs/indels i målet og tilstødende Pam sekvenser er særlig relevant, når designe grna, der er rettet mod regulerende Elementer.
En flaskehals i CRISPR/Cas9 genomredigering involverer screening af ønskede mutante kloner i et stort antal prøver. Vi beskæftigede fluorescerende PCR kombineret med kapillar gel elektroforese til screening som målet mutation er en lille genomisk sletning af omkring 300 BP. Denne metode er hurtig og følsom og kan udføres i en høj gennemløb mode. Denne metode giver også mulighed for nøjagtig estimering af mutant niveauer og sletnings størrelser samtidigt. Desuden understøttes multiplex-analyse af PCR-fragmenter, der er mærket med forskellige fluorescerende farvestoffer. Vi har rutinemæssigt brugt denne teknik til genotype små indsættelser/sletninger i myeloid neoplasmer65,66. I vores erfaring kan vi konsekvent opdage fragment størrelser, der er forskellige med 4 BP med høj præcision og mutant byrde ned til ~ 3%. Det skal dog bemærkes, at denne metode har en fragment størrelsesgrænse på 1.200 BP, og det er derfor ikke egnet til screening af store sletninger. Der kan heller ikke påvises base erstatninger (hvilket resulterer i uændret fragment størrelse) og potentielle hændelser uden for målgruppen i andre genomiske områder. For sidstnævnte, den kostbare hele genomsekvensering er forpligtet til at gennemgribende profilere globale uønskede ændringer i målet kloner. Til at vedtage vores nuværende tilgang til undersøgelse af store ikke-kodning lovgivningsmæssige sekvenser (> 1000 bp), en detaljeret sletning og mutagenese analyser af formodede transkriptionsfaktor bindingssteder ved hjælp in vitro reporter gen assays kan udføres på forhånd for at afgrænse det minimale funktionelle område for CRISPR/Cas9-redigering18.
Da mange gener indeholder mere end én projektledere3,4, er det vigtigt at være opmærksom på eksistensen af alternative promotorer i målgenlocus, da manipulerende reguleringselementer kan påvirke initiativtagerne differentieret. Transskriptions varianter fra forskellige initiativtagere skal derfor måles individuelt for at evaluere eventuelle promotor-specifikke svar. Brugen af TaqMan sonde-baserede assays foretrækkes frem for SYBR grøn på grund af bedre specificitet og reproducerbarhed. Hvis det mere avancerede digitale PCR-system er tilgængeligt, kan transskription kvantificeres mere præcist uden brug af standardkurve konstruktion.
En vigtig overvejelse i at udføre crispr/Cas9 eksperimenter i Cancer cellelinjer er Ploidi og Target gen kopi nummer i cellerne, der anvendes som stort set alle kræft cellelinjer Harbor genetiske ændringer, herunder strukturelle og kopiantal variationer. I vores tilfælde har OCI-AML3 en hyperdiploid karyotype med 45 til 50 kromosomer. Også, celle linjen blev fundet at bære en normal RUNX1 kopi nummer som afsløret fra Cancer Cell line Encyclopedia67 og fluorescens in situ hybridisering undersøgelser18. Når du målretter mod et gen med kopi nummer gevinst, skal leveringsmetoden muligvis optimeres for at give et tilstrækkeligt niveau af CRISPR-komponenterne til redigeringen. Også, flere kloner kan være nødvendigt at screenes for at identificere de komplette knockouts. Det er vigtigt, at det er blevet påvist, at målretning mod forstærkede genomregioner, især dem, der forårsages af strukturelle omordninger, kan udløse genuafhængige antiproliferativ reaktioner i cancerceller, hvilket fører til falsk positive resultater i gen funktionelle undersøgelser68,69,70. I denne forbindelse bør der anvendes alternative tilgange som RNA-interferens (RNAi)-Knockdown og/eller cDNA-overekspression til at verificere CRISPR-resultaterne. Der bør også bruges flere cellelinjer for at undgå fejlfortolkning af cellelinje specifikke, men genuafhængige CRISPR-redigerings effekter.
CRISPR/Cas9-systemet har revolutioneret grundlæggende og Translationel forskning ved at give et enkelt og effektivt middel til genomredigering. Her viser vi, hvor let det er at bruge CRISPR/Cas9 til at forstyrre en intronic lyddæmper til transkriptionelle studier i en Cancer cellelinje. Denne teknik giver mulighed for studiet af CREs på DNA-niveau og giver mulighed for at undersøge CRE funktioner i den endogene kontekst i stedet for de traditionelle heterolog reporter gener. For nylig er et CRISPR-baseret RNA redigeringssystem også blevet identificeret71 og kan tjene som et nyt værktøj til at studere CREs ved at målrette RNA transskriberet fra de lovgivningsmæssige elementer. Ved at kombinere med kromosom konstellation Capture teknikker, CRISPR/Cas9 vil helt sikkert hjælpe dechifrere involvering af CREs i ændret genomorganisation og genekspression forbundet med forskellige helbredsproblemer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Prof. M.D. Minden (Princess Margaret Cancer centre, University Health Network, Toronto, Canada) for at give OCI-AML3 Cell line. Også, forfatterne vil gerne takke de centrale værker af Cancer Genomics og Patogenbiologi (det kinesiske universitet i Hong Kong) for at levere de faciliteter og bistand til støtte for denne forskning.
0.2 cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
1×TE buffer, pH7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
10mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
PBS, 10X Solution, pH7.4 | Affymetrix | 75889 | |
Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |