Direkte levering av forhåndsmonterte Cas9/guide RNA ribonucleoprotein komplekser er en rask og effektiv måte for Genova redigering i blodkreft celler. Her bruker vi denne tilnærmingen til å slette en RUNX1 intronic lyddemper og undersøke transcriptional svar i OCI-AML3 Leukemic celler.
Hovedtyngden av den menneskelige Genova (~ 98%) består av ikke-koding sekvenser. CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-koding DNA-sekvenser som inneholder bindende områder for transcriptional regulatorer å modulere genuttrykk. Endringer av CREs har vært innblandet i ulike sykdommer, inkludert kreft. Mens arrangører og enhancers har vært den primære CREs for å studere gen regulering, svært lite er kjent om rollen til lyddemper, som er en annen type GROBUNN som formidler gen undertrykkelse. Opprinnelig identifisert som en adaptiv immunitet system i prokaryoter, CRISPR/Cas9 har blitt utnyttet til å være et kraftig verktøy for eukaryote Genova redigering. Her presenterer vi bruken av denne teknikken for å slette en intronic lyddemper i menneskets RUNX1 gen og undersøke virkningene på genuttrykk i OCI-AML3 Leukemic celler. Vår tilnærming er avhengig av electroporation-mediert levering av to forhåndsmonterte Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) komplekser for å lage to doble strand pauser (DSBs) som flanke lyddemper. Slettinger kan lett bli vist ved fragment analyse. Uttrykks analyser av ulike mRNAs som skrives ut fra alternative arrangører, bidrar til å evaluere arrangørens avhengige effekter. Denne strategien kan brukes til å studere andre CREs og er spesielt egnet for blodkreft celler, som ofte er vanskelig å transfect med plasmider-baserte metoder. Bruken av en plasmider-og virus fri strategi gir enkle og raske vurderinger av gen regulatoriske funksjoner.
CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-koding DNA-sekvenser som inneholder bindende områder for transcriptional regulatorer for å kontrollere genuttrykk1,2. Disse elementene er vanligvis 100 til 1 000 base parene (BP) lang. Arrangører og enhancers er de to mest preget typer CREs. Arrangører er til stede i umiddelbar nærhet til transkripsjon starte nettsteder og utgjør den grunnleggende enhet av transkripsjon. Mange gener har mer enn én promoter og deres alternative bruk bidrar til transcriptome mangfold og vev spesifisitet3,4. På den annen side, enhancers aktivere transkripsjon og kan være plassert oppstrøms, nedstrøms eller innenfor introns av målet gener. Enhancers kan handle fra langt avstand (over en megabase) og uavhengig av orientering1,2. CREs har også lyddempere og isolatorer5,6. Den tidligere handlinger oppositely til enhancers å hemme genuttrykk ved binding til transcriptional repressors, mens sistnevnte partisjonene i Genova i diskret topologisk domener å isolere gener fra andre CREs fra nabokommunene domener. Disse elementene handler i samspill med hverandre gjennom kort-og/eller langtrekkende kromatin interaksjoner og er organisert i regulatoriske huber til direkte riktig spatiotemporal genuttrykk. Nylige fremskritt i høy gjennomstrømming sekvensering teknikker har akselerert identifisering og funksjonell merknad av mange CREs som har i stor grad tilrettelagt vår forståelse av transcriptional nettverk som dikterer avstamning-spesifikke genet uttrykk i forskjellige celle-og vevstyper7,8,9, 10,11,12.
Gitt de grunnleggende rollene til CREs i regulering transkripsjon, kan deres endringer føre til avvikende genuttrykk. Det har vist seg at CREs er ofte forstyrret av genetiske og epigenetic endringer i ulike typer av menneskelig kreft, og dermed bidra til tumor innvielse, progresjon og aggressivitet13,14. I tillegg, GROBUNN-bindende faktorer er ofte mutert og/eller misexpressed i ulike krefttyper, ytterligere fremhever betydningen av GROBUNN dereguleringen i oncogenesis15. CREs kan også påvirkes av strukturelle avvik, som illustrert av hyppige kromosom rearrangements av immunglobulin tunge (IgH) gen Enhancer som resulterer i unormal aktivering av nabo oncogenes i B-celle lymfomer16. Ved akutt myelogen leukemi (AML), omplassering av en enkelt Enhancer av kromosom 3Q rearrangements forårsaker samtidig GATA2 Downregulation og EVI1 aktivering, som kan potensielt være målrettet av spill hemming av Enhancer funksjoner 17. nylig har vi karakterisert en roman kromosom translokasjon som involverer forstyrrelsene av en RUNX1 intronic lyddemper som kan bidra til AML progresjon i en pediatrisk pasient18. Således, tyde den ikke-koding kreft Genova gir fruktbare veier for Elucidating sykdom patogenesen, biomarkør oppdagelse og terapeutiske intervensjoner, som til slutt forbedre pasientens utfall.
CRISPR/Cas9 nuklease Pathway, opprinnelig identifisert som et adaptive immunsystem i prokaryote celler, har blitt utnyttet som en rask og kostnadseffektiv måte for områdespesifikk genomisk redigering i levende celler og organismer19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9-systemet omfatter to hovedkomponenter: gRNA og Streptococcus pyogenesCas9 nuklease. GRNA inneholder en bestemt sekvens kalt protospacer som gjenkjenner målområdet og dirigerer Cas9 for redigering. GRNA består av to deler: CRISPR RNA (crRNA), vanligvis en 20-mer nukleotid sekvens komplementær til mål-DNA, og en trans-aktivere crRNA (tracrRNA), som fungerer som et bindende stillas for nuklease. En protospacer tilstøtende motiv (PAM) (5 ‘-NGG) umiddelbart ved siden av målet området er nødvendig for Cas9 kløft og kløften området ligger 3 nukleotider oppstrøms av PAM. CRISPR/Cas9-mediert genredigering er vanligvis utføres av transfecting celler med en plasmider det koder Cas9 og det klon gRNA23. Imidlertid er denne tilnærmingen utfordrende for blodkreft celler, som ofte er vanskelig å transfect og krever langvarige virus-baserte Transduction metoder. En alternativ tilnærming er direkte cellulær levering av forhåndsmonterte Cas9/gRNA RNP komplekser24. En vanlig metode for RNP levering er electroporation, som genererer midlertidige porer i cellemembranen, og dermed tillater oppføring av RNP komplekser i cellene25,26. Fordelene med denne tilnærmingen inkluderer brukervennlighet, redusert off-Target effekter og stabilitet av RNP komplekser. Her beskriver vi en protokoll for å bruke RNP Leveringsmetode for å undersøke transcriptional rollen til en RUNX1 intronic lyddemper i OCI-AML3 leukemi cellelinje18, som ble etablert fra PERIFERT blod av en AML pasient diagnostisert med den fransk-amerikanske-britiske M4 under type27. Protokollen inkluderer design av crRNA, utarbeidelse av RNP komplekser, electroporation samt screening og påfølgende karakterisering av de ønskede kloner.
Den CRISPR/Cas9 systemet har vært brukt i en rekke Genova redigering programmer som Gen knockout og knock-in studier35,36, transcriptional regulering37,38, genetisk engineering av ulike modell organismer39,40,41,42,43,44 og genterapi45,46. Her demonstrerer vi bruken av CRISPR/Cas9 for å undersøke de funksjonelle konsekvensene av å slette en intronic lyddemper på RUNX1 -genet. Leveransen av CRISPR komponenter i tilnærmingen vår var ikke avhengig av plasmider DNA, kloning av gRNA eller virus, men electroporation av forhåndsmonterte Cas9/gRNA RNP komplekser. Det har vist seg at bruk av eksogene DNA kan knyttes til uønsket integrering av utenlandske vektor sekvenser inn i verten Genova, økt toksisitet og lav effektivitet25,47,48, mens virus Transduction metoder er tidkrevende. I tillegg kan langvarig uttrykk for Cas9 fra plasmider DNA forsterke off-Target effekter48. Tvert imot, det direkte RNP-basert leveranse adgang er blitt etablerte idet det foretrakk metoden for den er rask og direkte med forbedret redigere bort effektiv, selektivitet og cellen levedyktighet. Faktisk, en rekke metoder som lipofection49,50, electroporation25,51, nanopartikler52, celle-gjennomtrengende peptider53, iTOP54 og TRIAMF 55 har blitt utviklet for effektiv CRISPR/Cas9 levering til ulike celletyper, samt dyre-og plantearter24,25,26,56,57 , 58 for alle , 59 for alle , 60 for alle , 61 for alle , 62 for alle , 63. siden ikke-koding DNA-sekvenser er hotspots av genetiske variasjoner64, sjekke tilstedeværelsen av vanlige SNPs/indeler i målet og nabolandet Pam sekvenser er spesielt relevant når du utformer gRNA som mål regulatoriske Elementer.
En flaskehals i CRISPR/Cas9 Genova redigering innebærer screening av ønsket mutant kloner i et stort antall prøver. Vi brukte fluorescerende PCR kombinert med kapillær gel elektroforese for screening som mål mutasjon er en liten genomisk sletting av ca 300 BP. Denne metoden er rask og følsom og kan utføres i en høy-gjennomstrømming mote. Denne metoden gir også nøyaktig estimering av mutant nivåer og slette størrelser samtidig. I tillegg støttes multiplex analyse av PCR-fragmenter merket med ulike fluorescerende fargestoffer. Vi har vært rutinemessig bruker denne teknikken til genotype små innsettinger/slettinger i myelogen svulster65,66. I vår erfaring, kan vi konsekvent oppdage fragment størrelser som er forskjellig fra 4 BP med høy presisjon og mutant byrde ned til ~ 3%. Imidlertid bør det bemerkes at denne metoden har et fragment størrelsesgrensen på 1 200 BP, og dermed er det ikke egnet for screening av store slettinger. Også basis erstatninger (som resulterer i uendret fragment størrelse) og potensielle hendelser utenfor mål i andre genomisk områder, kan ikke oppdages. For det latter, det kostbar hele Genova sekvensering er krevde å allsidig profil fleste uønsket endre inne målet klon. Å vedta vår nåværende tilnærming for etterforskning av store ikke-koding regulatoriske sekvenser (> 1000 BP), en detaljert sletting og mutagenese analyser av antatte transkripsjon faktor bindende nettsteder bruker in vitro reporter genanalyser kan utføres på forhånd for å avgrense den minimale funksjonelle regionen for CRISPR/Cas9 redigering18.
Som mange gener inneholder mer enn én arrangører3,4, er det viktig å være klar over eksistensen av alternative arrangører i målet genet geometriske som manipulerer regulatoriske elementer kan påvirke arrangørene differensielt. Dermed, transkripsjon varianter avledet fra ulike arrangører må måles individuelt for å evaluere eventuelle promoter-spesifikke tiltak. Bruk av TaqMan-sonde er foretrukket over SYBR Green på grunn av bedre spesifisitet og reproduserbarhet. Hvis den mer avanserte digitale PCR-systemet er tilgjengelig, transkripsjon kvantifisering kan utføres mer presist uten behov for standard kurve konstruksjon.
En viktig faktor i å utføre CRISPR/Cas9 eksperimenter i kreftcelle linjer er ploidy og målet genet kopi nummer i cellene brukes som nesten alle kreftcelle linjer havn genetiske endringer inkludert strukturelle og kopiere antall variasjoner. I vårt tilfelle har OCI-AML3 en hyperdiploid Karyotype med 45 til 50 kromosomer. I tillegg ble cellelinjen funnet å bære en normal RUNX1 kopi nummer som avslørt fra kreft Cell line Encyclopedia67 og fluorescens in situ hybridisering studier18. Når du målretter et gen med kopi nummer forsterkning, kan det hende leveringsmetoden må optimaliseres for å gi tilstrekkelige nivåer av CRISPR-komponentene for redigeringen. Dessuten kan flere kloner må bli vist for å identifisere den komplette Knockouts. Viktigere er det vist at målretting på forsterket genomisk regioner, spesielt de som skyldes strukturelle rearrangements, kan utløse gen-uavhengige antiproliferative responser i kreftceller, noe som fører til falske positive resultater i genet funksjonelle studier68,69,70. I denne forbindelse bør alternative tilnærminger som RNA-interferens (RNAi) knockdown og/eller cDNA-overuttrykte benyttes for å verifisere CRISPR-funnene. I tillegg bør flere cellelinjer brukes for å unngå feil tolkning av cellelinje spesifikke, men gen-uavhengige CRISPR redigerings effekter.
Den CRISPR/Cas9 systemet har revolusjonert grunnleggende og translational forskning ved å tilby en enkel og effektiv måte å Genova redigering. Her viser vi hvor enkelt det er å bruke CRISPR/Cas9 for å forstyrre en intronic lyddemper for transcriptional studier i en kreftcelle linje. Denne teknikken gjør det mulig for studiet av CREs på DNA-nivå og gir muligheter til å undersøke GROBUNN funksjoner i endogene sammenheng i stedet for den tradisjonelle heterologous reporter gener. Nylig har et CRISPR-basert RNA redigeringssystem også blitt identifisert71 og kan tjene som et nytt verktøy for å studere CREs ved å målrette RNA-er fra regulatoriske elementer. Ved å kombinere med kromosom konformasjon fangst teknikker, CRISPR/Cas9 vil sikkert hjelpe dechiffrere den engasjement av CREs i endrede Genova organisasjon og genuttrykk knyttet til ulike helseproblemer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Prof. MD Minden (prinsesse Margaret Cancer Centre, University Health Network, Toronto, Canada) for å gi OCI-AML3 cellelinje. Også forfatterne vil gjerne takke Core Utilities av Cancer Genomics og Pathobiology (The Chinese University of Hong Kong) for å gi fasiliteter og bistand til støtte for denne forskningen.
0.2 cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
1×TE buffer, pH7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
10mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
PBS, 10X Solution, pH7.4 | Affymetrix | 75889 | |
Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |