Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

Summary

Direktleverans av förmonterade Cas9/guide RNA ribonukleoprotein komplex är ett snabbt och effektivt sätt för genomredigering i hematopoietiska celler. Här använder vi denna metod för att ta bort en RUNX1 intronic ljuddämpare och undersöka transkriptionella svaren i OCI-AML3 leukemi celler.

Abstract

Huvuddelen av människans arvsmassa (~ 98%) består av icke-kodningssekvenser. CIS-regulatoriska element (CREs) är icke-kodning DNA-sekvenser som innehåller bindande platser för transkriptionella tillsynsmyndigheter att modulera genuttryck. Förändringar av CREs har varit inblandade i olika sjukdomar inklusive cancer. Medan initiativtagare och förstärkare har varit den primära CREs för att studera genreglering, mycket lite är känt om den roll som ljuddämpare, som är en annan typ av CRE som förmedlar gen förtryck. CRISPR/Cas9, som ursprungligen identifierades som ett adaptivt immunitetssystem i prokaryoter, har utnyttjats för att vara ett kraftfullt verktyg för eukaryotisk genomredigering. Här presenterar vi användningen av denna teknik för att ta bort en intronic ljuddämpare i human RUNX1 Gene och undersöka effekterna på genuttryck i OCI-AML3 leukemi celler. Vårt förhållningssätt förlitar sig på Electroporation-medierad leverans av två förmonterade Cas9/guide RNA (grna) ribonukleoprotein (RNP) komplex för att skapa två dubbel-strand raster (DSBs) som flanera ljuddämparen. Borttagningar kan lätt kontrolleras genom fragmentanalys. Uttrycks analyser av olika mRNA som transkriberas från alternativa promotorer hjälper till att utvärdera Promotorns beroende effekter. Denna strategi kan användas för att studera andra CREs och är särskilt lämplig för hematopoietiska celler, som ofta är svåra att transfect med plasmid-baserade metoder. Användningen av en Plasmid-och virusfri strategi möjliggör enkla och snabba bedömningar av gen reglerande funktioner.

Introduction

CIS-regulatoriska element (CREs) är icke-KODANDE DNA-sekvenser som innehåller bindningsställen för transkriptionella regulatorer för att kontrollera genuttryck^1,2. Dessa element är vanligtvis 100 till 1 000 baspar (BP) lång. Initiativtagare och förstärkare är de två mest karakteriserade typer av CREs. Initiativtagarna är närvarande i nära anslutning till avskrift startplatser och utgör den grundläggande enheten för transkription. Många gener har mer än en promotor och deras alternativa användning bidrar till transkriptome mångfald och vävnad specificitet^3,4. Å andra sidan, förstärkare aktivera transkription och kan lokaliseras uppströms, nedströms eller inom introner av målgener. Enhancers kan agera från långt avstånd (över en megabas) och oberoende av orientering^1,2. CREs inkluderar även ljuddämpare och isolatorer^5,6. Den förstnämnda agerar motsatt till förstärkare för att hämma genuttryck genom bindning till transkriptionella repressorer, medan den senare partitioner arvsmassan till diskreta topologiskt domäner att isolera gener från andra CREs från angränsande domäner. Dessa element fungerar i samförstånd med varandra genom kort-och/eller långväga kromatin interaktioner och är organiserade i regulatoriska nav för att direkt korrekt spatiotemporal genuttryck. Senaste framstegen i hög genomströmning sekvenserings tekniker har påskyndat identifiering och funktionell anteckning av många CREs som avsevärt har underlättat vår förståelse av transkriptionella nätverk som dikterar härstamnings-specifik gen uttryck i olika cell-och vävnadstyper^{7,8,9,10,11,12}.

Med tanke på de grundläggande rollerna för CREs i regleringen av transkription, kan deras förändringar leda till avvikande genuttryck. Det har visats att CREs ofta störs av genetiska och epigenetiska förändringar i olika typer av mänskliga cancerformer, vilket bidrar till tumör initiering, progression och aggressivitet^13,14. Dessutom är CRE-bindande faktorer ofta muterade och/eller misexpressed i olika cancertyper, ytterligare belysa betydelsen av CRE avreglering i Onkogenes¹⁵. CREs kan också påverkas av strukturella avvikelser, som exemplifieras av frekventa kromosomala omställningar av immunglobulin tunga (IgH) gen förstärkare som resulterar i onormal aktivering av angränsande onkogener i B-cells lymfkörtelcancer¹⁶. Vid akut myeloisk leukemi (AML), omplacering av en enda förstärkare av kromosom 3Q omordningar orsakar samtidig GATA2 nedreglering och EVI1 aktivering, som kan potentiellt riktas genom att satsa hämning av förstärkare funktioner ¹⁷. nyligen, vi kännetecknas en roman kromosom flyttning med störning av en RUNX1 intronic ljuddämpare som kan bidra till AML progression i en pediatrisk patient¹⁸. Således, dechiffrera icke-kodning cancer arvsmassa ger givande vägar för att belysa sjukdomens patogenes, biomarkör upptäckt och terapeutiska interventioner, som i slutändan förbättra patientens resultat.

Den CRISPR/Cas9 Nuclease väg, ursprungligen identifierats som ett adaptivt immunsystem i prokaryotiska celler, har utnyttjats som ett snabbt och kostnadseffektivt sätt för platsspecifik genomisk redigering i levande celler och organismer^{19,20 ,21,22}. Den CRISPR/Cas9 systemet omfattar två huvudsakliga komponenter: den gRNA och Streptococcus pyogenes-derived Cas9 Nuclease. GRNA innehåller en specifik sekvens som kallas protospacer som känner igen målregionen och dirigerar Cas9 för redigering. Den gRNA består av två delar: CRISPR RNA (crRNA), typiskt en 20-mer nukleotid sekvens komplement till målet DNA, och en trans-aktiverande crRNA (tracrRNA), som fungerar som en bindande ställningen för Nuclease. Ett protospacer angränsande motiv (PAM) (5 ‘-NGG) omedelbart intill målplatsen krävs för Cas9 klyvning och klyvning platsen ligger 3 nukleotider uppströms PAM. CRISPR/Cas9-medierad genredigering utförs vanligen av transfecting celler med en Plasmid som kodar Cas9 och klonade gRNA²³. Emellertid, detta tillvägagångssätt är utmanande för hematopoietiska celler, som ofta är svåra att transfect och kräver långa virusbaserade transduktionmetoder. En alternativ metod är direkt cellulära leverans av förmonterade Cas9/gRNA RNP komplex²⁴. En vanlig metod för RNP leveransen är elektroporation, som genererar tillfälliga porer i cellmembranet, vilket möjliggör inträde av RNP-komplexen i cellerna^25,26. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är användarvänlighet, minskade off-Target effekter och stabiliteten i RNP komplexen. Här beskriver vi ett protokoll för att använda RNP leveransmetod för att undersöka den transkriptionella roll som en RUNX1 intronic ljuddämpare i OCI-AML3 leukemi cell linje¹⁸, som fastställdes från perifert blod av en AML-patient diagnostiserades med den fransk-amerikanska-brittiska M4 subtyp²⁷. Protokollet omfattar utformningen av crRNA, beredning av RNP-komplex, elektroporation samt screening och efterföljande karakterisering av de önskade klonerna.

Protocol

1. utformning av crRNA Designa två crrnas, en 5 ‘ och den andra 3 ‘ av mål-CRE med hjälp av ett webbaserat CRISPR designverktyg28,29,30,31. Se till att en PAM av NGG ligger omedelbart nedströms i målsekvensen för Cas9 erkännande. Utformningen av de två crRNAs (crRNA-1 och crRNA-2) för strykningen av RUNX1 ljuddämpare18 visas i figur 1.Anmärkning: Ett crRNA innehåller vanligtvis en 20-mer protospacer som kompletterar målsekvensen. Kontrollera närvaron av enstaka nukleotid polymorfismer (SNPs)/indels i målet och angränsande pam sekvenser genom att ange genomiska platser av sekvenser i sökrutan på en online arvsmassa webbläsare (t. ex., ncbi 1000 genom eller ucsc Genome Browser).Anmärkning: Vanliga SNP/indels har en mindre Allelefrekvens på minst 1% i den allmänna populationen. Skicka in de valda crRNA-sekvenserna för syntes med en kommersiell leverantör. Också, köpa tracrRNA för gRNA duplex formation. 2. utformning av Screeningprimers för radering Designa ett par primers som flankerar den avsedda borttagnings regionen. Se till att primers är minst 50 BP från Cas9 klyvning platser så att PCR amplifiering påverkas minimalt av indels bildas på klyvning platser. Se till att amplikon är mindre än 1 200 BP (helst mindre än 600 BP för bättre storlek upplösning). Också, etikett en av primers med en fluorescerande färg (t. ex., 6-karboxyfluorescein (6-FAM)) vid 5 ‘-slut för detektion. De primers som används för screening av RUNX1 ljuddämpare deletion18 visas i figur 1. 3. beredning av Cas9/gRNA RNP-komplex Omsuspendera crRNAs och tracrRNA i 1x TE-buffert (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) till en slutlig koncentration av 200 μM. För varje crRNA, blanda 2,2 μL av 200 μM crRNA, 2,2 μL av 200 μM tracrRNA och 5,6 μL 1x TE buffert (totalt 10 μL) i en 0,2 mL tub för att få en slutlig duplex koncentration av 44 μM. Inkubera vid 95 ° c i 5 minuter i en ThermoCycler. Låt rören svalna till rumstemperatur för gRNA Complex formation. Späd 10,4 μL av 62 μM rekombinant Cas9 Nuclease med 7,6 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att erhålla en slutlig nukleaskoncentration på 36 μM.Anmärkning: Detta belopp är tillräckligt för beredning av två Cas9/gRNA komplex. Blanda lika volymer (8,5 μL) av de utspädda nukleaserna med var och en av de gRNA duplex som erhållits från steg 3,3. Inkubera i rumstemperatur i 20 minuter för att tillåta RNP-komplexbildning. Håll blandningar på is tills elektroporation. 4. elektroporering av RNP-komplexen till OCI-AML3-celler Kultur OCI-AML3 celler i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 enheter/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin (hädanefter kallat fullständigt RPMI 1640 medium) vid 37 ° c med 5% CO2. Räkna celler med trypan Blåfärgning. Se till att cellernas lönsamhet vid tiden för elektroporation är över 90%. Centrifugera 2,5 x 106 celler i en 1,5 ml tub vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 1 mL 1x PBS. Snurra ner cellerna igen och ta bort alla kvarvarande supernatanten. Omsuspendera cellerna i 163 μL RPMI 1640-medium utan fenolrött.  Tillsätt 16,7 μL av varje RNP-komplex (från steg 3,6) och 3,6 μL av 100 μM Elektroporationshöjande till cellerna (total volym = 200 μL). Blanda försiktigt genom pipettering.Anmärkning: Den Electroporation Enhancer är en bärare DNA för att förbättra redigering effektivitet. Överför blandningen till en 0,2 cm-gap elektroporation kyvetten utan bubblor. Utför elektroporation med ett elektroporeringssystem (läge: exponentiell; Spänning =: 150 V; Kapacitans = 700 μF; Resistans = 50 Ω). Överför cellerna till en T-25 vävnadskultur kolv innehållande 6 mL komplett RPMI 1640 medium och inkubera vid 37 ° c med 5% CO2. 5. screening och val av Cellkloner med biallelic borttagningar Späd cellerna till 5 x 103/ml i komplett rpmi 1640 medium en dag efter elektroporation. Tillsätt 100 μL av den utspädda cellsuspensionen i varje brunn av 96-väl vävnad kultur plattor och låta cellerna att växa för 7-14 dagar. Extrahera genomiskt DNA från cellerna med hjälp av ett högflöde reningssystem. Tillsätt 100 μL plattbindning och lyseringsbuffert till varje brunn på en 96-brunn extraktionsplatta. Tillsätt 5 x 104 celler som återsuspenderas i 10 μl 1x PBS till bufferten och blanda dem med pipettering. Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter för att möjliggöra bindning av genomiskt DNA till brunnarna. Aspirera lösningen från brunnarna utan att skrapa på brunnen ytbehandlar. Tvätta brunnarna med 120 μL tvättbuffert. Lufttorka brunnarna som innehåller det bundna DNA- Förbered 20 μL PCR-blandning (2 μL 10X High Fidelity-buffert, 0,8 μL av 50 mM MgSO4, 0,4 μl 10 mm dNTPs, 0,4 μl av 10 μm fam-märkt framåtprimer (steg 2,2), 0,4 μl av 10 μm omärkt omvänd primer och 0,4 U av Taq DNA-polymeras för varje prov).Anmärkning: Förbered en Master Mix för att säkerställa tillsats av standardiserade mängder reagens i varje prov. Tillsätt PCR-mixen till varje brunn av extraktionsplattan och kör reaktionerna i en termocycler (villkorar: initialt 94 ° c för 2 minuter, följt av 35 cyklar av 94 ° c för 15 s, 56 ° c för 30 s och 68 ° c för 1 minuter). Uppskatta mängden av produkterna genom att mäta deras koncentrationer i ett utvalt antal prover med hjälp av en fluorometer. Späd ut alla prover med nukleasfri H2O till 0,5 ng/μl. Blanda 1 μL av de utspädda PCR-produkterna med 8,5 μL avjoniserat formamid och 0,5 μL av fluorescerande Dye-märkt storleks standard i en 96-bra tallrik som är kompatibel med den genetiska analysatorn.Anmärkning: Förbered en Mastermix som innehåller avjoniserad formamid och storleks standard. Täck plattan med en tallrik septa och denaturera proverna vid 95 ° c i 3 min i en ThermoCycler. Stäng inte locket på maskinen. Utför kapillärgelelektrofores för att separera de märkta PCR-produkterna som beskrivits tidigare32. Efter elektrofores, öppna analysprogramvara för att analysera resultaten. Klicka på nytt projekt och välj mikrosatellit. Klicka sedan på OK. Klicka på Lägg till exempel i Project och välj resultatfilerna (innehåller tillägget. FSA). Klicka sedan på Lägg till i listan för att importera filerna. Välj Mikrosatellitstandard i kolumnen analysmetod i tabellen som visar de valda resultatfilerna. Välj också den storleks standard som används i kolumnen storleks standard . Klicka sedan på ikonen analysera , ange experimentets namn och spara experimentet. Klicka på Visa tomter för att visa resultaten och välj fragmentanalys i plottinställningen. Välj lämpliga färgade kanaler för analys. Kontrollera den orangefärgade ikonen för att visa de märkta fragmenten i storleks standarden för att bedöma kvaliteten på samtal. Kontrollera den blå ikonen för att visa de märkta PCR-produkterna. Identifiera de toppar som motsvarar Wild-Type och Mutant (dvs. med förväntade borttagningar) produkter. Beräkna mutantnivån i varje prov genom att dividera arean under den muterade toppen med summan av området under Wild-Type-och Mutant-topparna. Välj flera cellpooler med höga nivåer av förväntade borttagningar för ytterligare seriella utspädningar. Upprepa DNA-extraktion, fluorescerande PCR och kapillärelektrofores steg. Välj cell kloner med Mutant nivåer > 95% representerar biallelic borttagningar för efterföljande analyser. Kontrollera identiteten för borttagningarna i de valda klonerna med Sanger-sekvensering. 6. funktionella analyser av ljuddämparen som tas bort genom real tids kvantitativ RT-PCR-analys Extrahera totalt RNA från de valda klonerna och utföra komplementär DNA (cDNA) syntes. Blanda 1 μg RNA med 1 μL 50 μM oligo (dT)20 primer och 1 μl 10 mm dNTP-blandning i en total volym på 10 μl. Inkubera vid 65 ° c i 5 min och Lägg sedan på is i minst 1 min. Tillsätt 10 μL cDNA-syntes blandning innehållande 2 μL 10X RT-buffert, 4 μL 25 mM MgCl2, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl RNase-hämmare (40 u/μl) och 1 μl omvänt transkriptas (200 U/μl). Inkubera vid 50 ° c för 50 min och sedan 85 ° c i 5 min i en termocycler.Anmärkning: Förbered en Master Mix för omvänd Transkription. Chill proverna på isen. Tillsätt 1 μL av RNase H och inkubera vid 37 ° c i 20 min. Förvara cDNA vid-20 ° c. Design primers och TaqMan sonder som specifikt känner igen enskilda transkription varianter genereras från alternativa projektansvariga.Anmärkning: Pre-designade transkription-specifika primer/sond-apparater är kommersiellt tillgängliga. Klona DNA-fragment som innehåller de specifika transkriptionssekvenserna till plasmid DNA. Bered en 10-faldig spädningsserie (106 till 10 kopior) av de rekombinanta plasmiderna som standardkurvor för kvantifiering av transkriptionen. Förbered 20 μL PCR-blandning (0,5 μL DNA-mall, 1 μL 20x färdigdesignad TaqMan-sond/primer-analys och 10 μL 2x TaqMan PCR Master Mix) för varje prov (både cDNA-och plasmid-standarder). Mät varje prov i tre exemplar.Anmärkning: Förbered en Mastermix för realtids PCR. Kör reaktionerna i en realtids PCR-maskin (villkor: initial 50 ° c för 2 min och 95 ° c i 10 min, följt av 40 cykler på 94 ° c i 15 s och 60 ° c i 1 min). Efter amplifieringen klickar du på ikonen analysera i programvaran för att analysera data. Kontrollera lutningen och korrelationskoefficienten för standard kurvorna för att utvärdera reaktioners effektivitet och linearitet. Se till att backarna är mellan-3,1 och-3,6 och korrelationskoefficienterna är större än 0,99. Normalisera kopierings numret för mål avskrifter i varje prov med en städ-gen (t. ex. GAPDH).

Representative Results

Syftet med detta experiment är att ta bort en intronic ljuddämpare i RUNX1 genen och undersöka effekterna på RUNX1 transkription i OCI-AML3 celler. Ljuddämparen identifierades med en kombinatorisk molekylär metod och konstaterades innehålla en 209 BP kärnelement18. För att möjliggöra en mer exakt utvärdering av detta kärnelement i kontrollen av RUNX1 uttryck utformades crRNAs (crrna-1 och crrna-2) för att rikta in sig nära denna region18 (figur 1). Den förutspådde Cas9 klyvning platser som väckts av crRNA-1 och crRNA-2 var 29 BP och 35 BP från kärn elementet, respektive (figur 1). Det bör noteras att medan PAM platser av de två crRNAs bor på motsatta strängar, DSBs kommer att ske oberoende av PAM sekvens plats. Sålunda, samtidig införandet av två Cas9/grna RNP komplex styrs av crrna-1 och crrna-2 förväntas att accis den ljuddämpare elementet från RUNX1 Locus. Till skärm för de önskade borttagningarna i ett stort antal prover, en 96-väl format av genomisk DNA Extraction Kit användes för hög genomströmning rening. Också, DNA bunden på brunnarna av extraktionsplattorna kan utsättas för direkt förstärkning, vilket minimerar fel eller kontaminering på grund av upprepad provöverföring. De primers som används för screening av borttagningarna18 visas i figur 1. Den förväntade storleken på Wild-Type PCR-produkten är ca 500 BP. Eftersom den avsedda borttagningen spänner över 273 BP, den muterade produkten förväntas vara cirka 230 BP. Denna storleksklass möjliggör enkel och snabb fragmentanalys av kapillärgel elektrofores. Sammanlagt 160 initiala cellpooler screenades och 14 konstaterades bära de förväntade borttagningarna med muterade nivåer på minst 70%. Fem pooler valdes sedan för ytterligare seriella utspädningar för att identifiera kloner som bär biallelic borttagningar. Representativa elektrofoniogram från cellkloner med olika nivåer av muterade produkter visas i figur 2A. Identiteten på borttagningarna kontrollerades av sanger-sekvensering (figur 2B). Som förväntat, indels bildas av icke-homolog sammanfogning reparation av DSBs33 observerades vid den förutspådda klyvning platser i strykningen kloner. Dessa resulterade i förstärkning av muterade produkter av varierande storlek, vilka också kunde upptäckas genom kapillärelektrofores (figur 2a). Den RUNX1 genen innehåller två initiativtagare nämligen distala P1 och proximala P2, som skiljs åt av en stor intron härbärgen ljuddämpare elementet34. Tre stora mRNA-utskrifter produceras av dessa initiativtagare: RUNX1c av P1 och RUNX1a och RUNX1b av P234. Den nukleotidsekvens av RUNX1c och RUNX1b är identiska utom den förstnämnda har en unik N-Terminus, från vilken en specifik TaqMan gen uttrycks analys kan utformas (figur 3a). För att mäta RUNX1banvändes en TaqMan-analys som erkände både RUNX1b och RUNX1c (figur 3a). RUNX1b nivåer bestämdes då genom att subtrahera total RUNX1b/RUNX1c från RUNX1c. RUNX1a är en distinkt kortare isoform på grund av alternativa skarvning och en specifik TaqMan-analys finns tillgänglig för denna variant (figur 3a). Aktiviteten hos projektansvariga P1 och P2 kan således bestämmas individuellt. Kvantitativa RT-PCR i real tid visade att strykningen av ljuddämparen avsevärt uppställde uttrycksnivåerna för både P1-och P2-härledda utskrifter (figur 3B). Figur 1 : Strategi för att ta bort RUNX1 intronic ljuddämpare. Ljuddämparen (röd ruta) är placerad i den första intron av RUNX1 -genen som separerar de två projektansvariga P1 och P2 (hg19 koordinater visas). Två crRNAs (crRNA-1 och crRNA-2) utformades för att introducera DSBs som flör ljuddämparen elementet. Den förutspådda Cas9 klyvning platser indikeras av vertikala röda linjer och PAM platser (NGG) är i lila. De två primers som används för gallring av borttagningar representeras av öppna pilar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2 : Identifiering av borttagandet kloner. A) representativa elektrofoniogram av cellkloner som uppvisar olika nivåer av MUTERADE PCR-produkter (MUT). Storleken på muterade produkter varierar mellan klonerna på grund av indels bildas på klyvning platser. WT = Wild-Type. Bkontroll av borttagningar från representativa kloner med Sanger-sekvensering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3 : Funktionella följder av ljuddämparen radering. A) de tre stora RUNX1 isoformerna (RUNX1a, RUNX1b och RUNX1c) visas. Dessa varianter innehåller samma runt DNA-bindnings domän men olika N-(orange) eller C-terminus (blå). Placeringen av TaqMan sond/primer par indikeras av röda linjer. Siffror indikerar aminosyran rester. B) kvantitativ RT-PCR-analys i real tid av RUNX1 P1-och P2-härledda utskrifter i cellpopulationer med (del) eller utan (WT) biallelic-borttagningar18. GAPDH användes för normalisering. * och * * ange p < 0,05 och p &Lt; 0,01 respektive av Mann-Whitney-provet. Denna siffra har modifierats från Cheng et al.18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

CRISPR/Cas9-systemet har använts i ett brett spektrum av gen redigeringsprogram såsom genknockout och Knock-in-studier^35,36, transkriptionell reglering^37,38, genteknik av olika modellorganismerna^{39,40,41,42,43,44} och genterapi^45,46. Här demonstrerar vi användningen av CRISPR/Cas9 för att undersöka de funktionella konsekvenserna av att ta bort en intronic ljuddämpare på RUNX1 genen. Leveransen av CRISPR komponenter i vår strategi inte förlita sig på plasmid DNA, kloning av gRNA eller virus men elektroporation av förmonterade Cas9/gRNA RNP komplex. Det har visats att användning av EXOGEN DNA kan associeras med oönskad integration av främmande vektorsekvenser i värdens arvsmassa, ökad toxicitet och låg verkningsgrad^25,47,48, medan virustransduktionmetoder är tidskrävande. Dessutom, långvarig uttryck av Cas9 från plasmid DNA kan öka off-mål effekter⁴⁸. Tvärtom, den direkta RNP-baserade leveransmetoden har etablerats som den bästa metoden eftersom det är snabbt och enkelt med förbättrad redigering effektivitet, selektivitet och cellernas lönsamhet. Faktum är att en mängd olika metoder såsom lipofection^49,50, elektroporation^25,51, nanopartiklar⁵², cell-penetrerande peptider⁵³, itop⁵⁴ och triamf ⁵⁵ har utvecklats för effektiv CRISPR/Cas9 leverans till olika celltyper samt djur-och växtarter^{24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63}. eftersom icke-kodning av DNA-sekvenser är hotspots för genetiska variationer⁶⁴, kontrollera närvaron av gemensamma SNPs/indels i målet och angränsande pam sekvenser är särskilt relevant när man utformar grna som mål reglerande Element.

En flaskhals i CRISPR/Cas9 genom redigering innebär screening av önskade muterade kloner i ett stort antal prover. Vi anställda fluorescerande PCR tillsammans med kapillär gel elektrofores för screening som mål mutation är en liten genomisk radering av cirka 300 BP. Denna metod är snabb och känslig och kan utföras i en hög genomströmning mode. Dessutom tillåter denna metod korrekt uppskattning av muterade nivåer och borttagnings storlekar samtidigt. Dessutom stöds multiplex-analys av PCR-fragment som märkts med olika fluorescerande färgämnen. Vi har rutinmässigt använder denna teknik för att genotyp små införanden/borttagningar i myeloida neoplasmer^65,66. Enligt vår erfarenhet kan vi konsekvent upptäcka fragment storlekar som skiljer sig med 4 BP med hög precision och Mutant börda ner till ~ 3%. Det bör dock noteras att denna metod har en fragmentstorlek gräns på 1 200 BP, och därmed är det inte lämpligt för screening av stora borttagningar. Dessutom kan inte bas ersättningar (resulterande i oförändrad fragmenstorlek) och potentiella händelser utanför mål i andra genomiska regioner upptäckas. För den senare, den kostsamma hela Genomsekvensering krävs för att utförligt profilera globala oönskade förändringar i mål klonerna. För att anta vår nuvarande strategi för utredning av stora icke-kodning regulatoriska sekvenser (> 1000 BP), en detaljerad radering och mutagenes analyser av förmodade transkriptionsfaktor bindningsställen med in vitro -reporter genanalyser kan utföras i förväg för att avgränsa den minimala funktionella regionen för CRISPR/Cas9 redigering¹⁸.

Eftersom många gener innehåller mer än en initiativtagare^3,4, är det viktigt att vara medveten om förekomsten av alternativa initiativtagare i mål genen Locus som manipulerande reglerande faktorer kan påverka initiativtagarna Differentiellt. Transkriptionsvarianter som härleds från olika projektansvariga måste därför mätas individuellt för att utvärdera eventuella projektspecifika svar. Användning av TaqMan sond-baserade analyser är att föredra framför SYBR Green på grund av bättre specificitet och reproducerbarhet. Om det mer avancerade digitala PCR-systemet finns tillgängligt, kan transkriptionskvantifieringen utföras mer exakt utan behov av standardkurva konstruktion.

En viktig faktor i att utföra CRISPR/Cas9 experiment i cancer cellinjer är ploidi och mål gen kopia nummer i de celler som används som praktiskt taget alla cancer cellinjer Harbor genetiska förändringar inklusive strukturella och kopiera nummer variationer. I vårt fall, OCI-AML3 har en hyperdiploid karyotyp med 45 till 50 kromosomer. Dessutom konstaterades cellinjer att bära en normal RUNX1 kopia nummer som avslöjas från cancer cellinjer Encyclopedia⁶⁷ och fluorescens in situ hybridisering studier¹⁸. När du riktar en gen med kopia antal Gain, leveransmetoden kan behöva optimeras för att ge tillräckliga nivåer av CRISPR komponenter för redigering. Dessutom kan fler kloner behöva screenas för att identifiera hela Knockouts. Framför allt har det visats att inriktning på förstärkta genomiska regioner, särskilt de som orsakas av strukturella omordningar, kan utlösa gen oberoende antiproliferativa reaktioner i cancerceller, vilket leder till falskt positiva resultat i gen funktionella studier^68,69,70. I detta avseende bör alternativa metoder som RNA-interferens (RNAi) knockdown och/eller cDNA-överuttryck användas för att kontrollera CRISPR-fynden. Dessutom bör flera cellinjer användas för att undvika feltolkningar av celllinjespecifika men gen oberoende CRISPR-redigeringseffekter.

CRISPR/Cas9-systemet har revolutionerat grundläggande och translationell forskning genom att tillhandahålla ett enkelt och effektivt sätt att genomredigera. Här visar vi hur lätt det är att använda CRISPR/Cas9 för att störa en intronic ljuddämpare för transkriptionella studier i en cancer cells linje. Denna teknik möjliggör studiet av CREs på DNA-nivå och erbjuder möjligheter att undersöka CRE funktioner i endogena sammanhang snarare än den traditionella heterologa reporter gener. Nyligen har en CRISPR-baserade RNA-redigeringssystem också identifierats⁷¹ och kan fungera som ett nytt verktyg för att studera CREs genom att rikta RNA transkriberas från de reglerande elementen. Genom att kombinera med kromosom konformation fånga tekniker, CRISPR/Cas9 kommer säkerligen att hjälpa dechiffrera inblandning av CREs i förändrad arvsmassa organisation och genuttryck kopplade till olika hälsoproblem.

Materials

0.2 cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086
1×TE buffer, pH7.5	Integrated DNA Technologies	11-01-02-02
10mM dNTP mix	Thermo Fisher Scientific	18427013
3500 Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	Thermo Fisher Scientific	None
7300 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	None
7300 System SDS Software	Thermo Fisher Scientific	None	Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system	Bio-Rad	1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well	Thermo Fisher Scientific	CS11205
crRNA-1	Integrated DNA Technologies	Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA	Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2	Integrated DNA Technologies	Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA	Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
Electroporation Enhancer	Integrated DNA Technologies	1075915
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32857
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4408399
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
PBS, 10X Solution, pH7.4	Affymetrix	75889
Penicillin and streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Thermo Fisher Scientific	11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease	Integrated DNA Technologies	1081058	Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red	Thermo Fisher Scientific	11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays	Thermo Fisher Scientific	4331182	Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays	Thermo Fisher Scientific	4331182	Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays	Thermo Fisher Scientific	4331182	Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher Scientific	18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4304437
tracrRNA	Integrated DNA Technologies	1072533	Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Unlabeled PCR reverse primer	Thermo Fisher Scientific	None