التمايز من الثدي الماوس HC11 وخلايا EpH4
Summary
نحن نصف تقنيات الاستقراء التمايز من اثنين من خطوط الظهارية الثدي، HC11 و EpH4. في حين أن كلا تتطلب مصل ربلة الساق الجنين, الأنسولين, والبرولاكتين لإنتاج بروتينات الحليب, خلايا EpH4 يمكن أن تفرق تماما في الغلاف الشعاعي للثدي في ثقافة ثلاثية الأبعاد. وهذه النماذج التكميلية مفيدة لدراسات نقل الإشارات عن التمايز والأورام.
Abstract
الكادهيرين تلعب دورا هاما في تنظيم التمايز الخلية وكذلك الأورام. هنا نصف أصول وأساليب تحريض التمايز من اثنين من خطوط الخلايا الظهارية الثدي الماوس، HC11 وEpH4، واستخدامها لدراسة المراحل التكميلية لتطوير الغدة الثديية والتحول النيوبلاستيك.
وHC11 الماوس الثدي الظهارية خط الخلية نشأت من الغدة الثديية من حبل الحمل / ج الماوس. فإنه يميز عندما نمت إلى التقاء تعلق على سطح طبق بيتري البلاستيك في المتوسط التي تحتوي على مصل ربلة الساق الجنين وHydrocortisone، أناnsulin وProlactin (HIP المتوسطة). في ظل هذه الظروف، تنتج خلايا HC11 بروتينات الحليب α-casein وبروتين مصل اللبن الحمضية (WAP)، على غرار الخلايا الظهارية الثديية المرضعة، وتشكل هياكل بدائية تشبه الغدة الثديية يطلق عليها “القباب”.
تم اشتقاق خط الخلية EpH4 من خلايا الغدة الثديية الظهارية للفأر ة الخالدة تلقائيًا والمعزولة عن فأر ة Balb/c الحامل. على عكس HC11، يمكن لخلايا EpH4 أن تفرق بشكل كامل إلى كرويدات (تسمى أيضًا الغلاف الشعاعي للثدي) عندما يتم استزراعها في ظل ظروف نمو ثلاثية الأبعاد (3D) في وسط HIP. الخلايا هي التربس، علقت في مصفوفة 20٪ تتكون من خليط من البروتينات مصفوفة خارج الخلية التي تنتجها Engelbreth-Holm-سرب (EHS) خلايا ساركوما الماوس، مطلي على الجزء العلوي من طبقة من مصفوفة مركزة طلاء طبق بيتري البلاستيك أو لوحة متعددة الآبار، وتغطي مع طبقة من 10٪ المتوسطة HIP التي تحتوي على مصفوفة. في ظل هذه الظروف، تشكل خلايا EpH4 كرويات جوفاء تحمل قطبية أبوية القاعدية، وهي تجويف أجوف، وتنتج الفيسين والواب.
باستخدام هذه التقنيات، أظهرت نتائجنا أن شدة إشارة الكادهيرين/راك أمر بالغ الأهمية للتمايز بين خلايا HC11. في حين أن Rac1 ضروري للتمايز والمستويات المنخفضة من تنشيط RacV12 زيادة التمايز، وارتفاع مستوياتV12 Rac كتلة التمايز في حين حفز الأورام. في المقابل ، تمثل خلايا EpH4 مرحلة مبكرة في التمايز الظهاري mammary ، والذي يتم تثبيطه حتى من خلال مستويات منخفضة من RacV12.
Introduction
في الأنسجة العادية أو الأورام ، والخلايا لديها فرص واسعة للالتصاق لجيرانها في منظمة ثلاثية الأبعاد ، وهذا يحاكي في الثقافة من قبل نمو الخلايا عالية الكثافة. يتم التوسط في الالتصاق من خلية إلى خلية بشكل رئيسي من خلال مستقبلات الكادهيرين ، والتي تحدد بنية الخلايا والأنسجة. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت مؤخرا أن الكاديرين تلعب أيضا دورا قويا في نقل الإشارات، وخاصة في البقاء على قيد الحياة إشارة1. ومن المفارقات أن بعض إشارات الالتصاق من الخلية إلى الخلية الصادرة من الكادهيرين وجدت مؤخراً أن كل من التمايز والأورام2مشتركة. هنا، ونحن نصف أساليب التعريفي وتقييم التمايز في نوعين تمثيليين من خطوط الخلايا الظهارية الثدي الماوس، HC11 وEpH4.
يمكن أن يوفر خط الخلية الظهارية للثدي من طراز HC11 نموذجًا مفيدًا لدراسة تمايز الخلايا الظهارية. خلايا HC11 هي خط خلية مشتق من COMMA-1D ، منتقاة من الغدة الثديية لفأرة Balb/c 3 الحامل متوسطةالحمل. على النقيض من غيرها من المستنسخين المشتقة COMMA-1D ، فإن استنساخ HC11 ليس لديه أي شرط لمصفوفة خارج الخلية المضافة أو الزراعة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى للتحريض المختبري لجين اللاكسين الذاتي ة الذاتية بواسطة الهرمونات اللاكتراجينية3. وقد استخدم هذا الخط الخلية على نطاق واسع في دراسات التمايز لأنه احتفظ بخصائص هامة للظهارة الثديية العادية: يمكن لخلايا HC11 إعادة تشكيل ظهارة القناة جزئيًا فيوسادةالدهون الثديية 4 . وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تميز في ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) عندما نمت إلى التقاء تعلق على سطح طبق بيتري البلاستيك في وجود الستيرويد مثل H ydrocortisone أو ديكساميثازون، بالإضافة إلى أناnsulin و P rolactin (HIP المتوسطة) تفتقر إلى عامل نمو البشرة (EGF)، وهو مثبط للتمايز 5،6،7. في ظل هذه الظروف، تنتج خلايا HC11 بروتينات الحليب مثل الفيسين والواب، والتي يمكن اكتشافها عن طريق النشاف الغربي في غضون 4 أيام بعد الحث. في الوقت نفسه ، يشكل جزء من خلايا HC11 هياكل بدائية تشبه الغدة الثديية يطلق عليها “القباب” بطريقة عشوائية. القباب مرئية 4-5 أيام بعد الاستقراء وزيادة تدريجية في الحجم حتى اليوم 10، بالتزامن مع زيادة في إنتاج الكيسينα 8. ومن المثير للاهتمام، خلايا HC11 تمتلك متحولة p539،وبالتالي تمثل حالة preneoplastic. لهذا السبب، فإن نموذج HC11 مناسب بشكل مثالي لدراسة إشارات شبكات التمايز بالاقتران مع الأورام في نفس نظام الخلية.
خلايا EpH4 ، وهي مشتقة من خلايا IM-2 ، هي خط خلية غير مورم مشتق في الأصل من خلايا الغدة الثديية الماوس الخالدة تلقائيًا المعزولة عن الفأر ة Balb /c متوسطة الحمل10. تشكل خلايا EpH4 أحادية ظهارية مستمرة في ثقافة ثنائية الأبعاد ، ولكنها لا تفرق إلى هياكل تشبه الغدية10،11. ومع ذلك، بعد نمو 3D في مادة تتكون من خليط من البروتينات مصفوفة خارج الخلية التي تنتجها خلايا ساركوما الماوس EHS12 (مصفوفة EHS، مصفوفة، أو Matrigel، انظر جدول المواد)،بالإضافة إلى التحفيز مع HIP، يمكن لخلايا EpH4 تلخيص المراحل الأولية للتمايز الغدة الثديية. في ظل هذه الظروف، تشكل خلايا EpH4 كرويات (تسمى أيضًا الغلاف الشعاعي للثدي) التي تحمل قطبية أبوية والقاعدية وتجويف أجوف، وهي قادرة على إنتاج بروتينات الحليب α-casein و WAP، على غرار الخلايا الظهارية الثديية المرضعة. على عكس خلايا HC11 ، والتي هي غير متمايزة ، وبعض علامات mesenchymal التعبير13، EpH4 الخلايا يحمل مورفولوجيا مضيئة بحتة14. وقد أفيد أيضا خلايا EpH4 لإنتاج بروتينات الحليب في ثقافة 2D من خلال التحفيز مع ديكساميثازون, الأنسولين, والبرولاكتين15. ومع ذلك، فإن هذا النهج يمنع دراسة الآثار التنظيمية التي تحاكي البيئة الدقيقة للغدة الثديية في الثقافة ثلاثية الأبعاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلايا HC11 مناسبة بشكل مثالي لدراسة التمايز بالتزامن مع التحول النيوبلاستيك. وتتمثل الميزة المضافة في أن خلايا HC11 يمكن أن تصيب بسهولة بناقلات الفيروسات الرجعية المستندة إلى Mo-MLV للتعبير عن مجموعة متنوعة من الجينات. في أيدينا، كانت خلايا EpH4 أكثر صعوبة لتصيب بنفس ناقلات الفيروسات الرجعية من H…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتكرم د. د. مدينا (هيوستن، تكساس) بتوفير خط الخلايا HC11. المؤلفون ممتنون للدكتور أندرو كريغ من جامعة كوينز للعديد من الكواشف والاقتراحات القيمة. كانت خلايا EpH4 هدية من الدكتور سي روسكيلي (UBC ، فانكوفر). قدمت كولين شيك مساعدة تقنية ممتازة لدراسات الثقافة ثلاثية الأبعاد.
المساعدة المالية من مجلس البحوث الطبيعية والهندسية في كندا ( NSERC ) ، المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، المؤسسة الكندية لسرطان الثدي (CBCF ، أونتاريو ) ، التحالف الكندي لأبحاث سرطان الثدي ، ومراكز أونتاريو للتميز، وسرطان الثدي العمل كينغستون (BCAK) وصندوق كلير نيلسون الوصية من خلال المنح إلى LR هو موضع تقدير بامتنان. كن تتلقى منحة الدعم من CIHR، CBCF، BCAK وجمعية أبحاث السرطان شركة PTG بدعم من رئيس البحوث الكندية، والمؤسسة الكندية للابتكار، CIHR، NSERC وجمعية السرطان الكندية. تم دعم MN من قبل الطلاب من برنامج تدريب تيري فوكس في أبحاث السرطان عبر التخصصات من NCIC، وجائزة الدراسات العليا (QGA)، وجائزة عميد من جامعة كوينز. تم دعم MG من خلال زمالات ما بعد الدكتوراه من برنامج الجيش الأمريكي لسرطان الثدي، ووزارة البحث والابتكار في مقاطعة أونتاريو ولجنة البحوث الاستشارية في جامعة كوينز. تم دعم VH من خلال زمالة الدكتوراه CBCF وزمالة ما بعد الدكتوراه من برنامج تدريب مؤسسة تيري فوكس في أبحاث السرطان عبر التخصصات بالشراكة مع CIHR. كان هاناد دان متلقياً لطالب صيفي من NSERC. تم دعم البكالوريس من قبل جائزة الدراسات العليا في جامعة كوينز.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
Riferimenti
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).
