HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리
Summary
모유는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 전송하지만 HIV에 감염된 어머니가 모유로 기르는 유아의 15 %만이 감염됩니다. 모유로 기르는 유아는 ~ 105-10 8 이 세포가 understudyed 하더라도 매일8 개의 모계 백혈구를 섭취합니다. 여기에서 우리는 모유 백혈구의 격리및 그들의 식세포 용량의 분석을 기술합니다.
Abstract
항 레트로 바이러스 약물이없는 경우에도 HIV에 감염된 어머니가 모유를 수유한 유아의 ~ 15 %만이 감염되어 모유 (BM)의 강력한 보호 효과를 시사합니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된 산모에게 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM 전송을 줄이기 위해 여러 가지 요인이 함께 작동할 가능성이 높습니다. 모유로 기르는 유아는 매일 ~ 105-108 모계 백혈구를 섭취하지만, 크게 불분명남아있는 것은 BM의 항 바이러스 특성에 대한 이러한 세포의 기여입니다. 항체 의존성 세포 식세포증 (ADCP), HIV 표적에 대하여 BM 식세포에 의해 가장 필수적이고 보편적인 선천적인 선천적인 면역 반응의 한개. 세포는 수유의 다양한 단계에서 수득된 5개의 인간 BM 샘플로부터 분리되었다. 격리는 부드러운 원심분리를 통해 수행되었고, 그 다음에 우유 지방을 주의 깊게 제거하고 세포 펠릿을 반복적으로 세척시켰다. HIV 봉투(Env) 에피토프로 코팅된 형광 비드는 ADCP의 분석을 위한 표적으로 사용하였다. 세포는 백혈구를 확인하기 위해 CD45 표면 마커로 염색하였다. ADCP 활성이 HIV 특이적 항체 830A를 사용하여 대조군 실험 및 재현 가능한 측정가능한 위 유의한 것으로 나타났다.
Introduction
인간 모유 (BM)는 >90% 실행 가능한1모계 세포로 구성됩니다. 세포 조성은 수유의 단계, 어머니와 유아의 건강 상태 및 개인 변화에 의해 강하게영향을 받는데, 이는1,2,3,4. BM이 ~ 103-105 백혈구 / mL을 함유하고 있음을 감안할 때, 모유 수유 된 유아가매일~ 105-108 모계 백혈구를 섭취한다고 추정 할 수 있습니다. 생체 내 다양한 연구는 모계 백혈구가 유아에게 중요한 면역력을 제공하고 초기섭취5, 6,7,8의 이러한 부위를 훨씬 넘어서 는 기능성을 입증했습니다. ,9,10,11. 유아에 의해 섭취된 모든 모계 유래 세포는 유아의 백혈구12와함께 면역 기능을 수행하거나 보상할 가능성이 있다.
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 어머니 -투 – 아이 전송 (MTCT)는 자원 제한 국가에서 위기 남아있다. 설사와 호흡기 질환이 자원 제한 국가에서 유아 중 사망률의 상당한 비율에 대한 책임이 있기 때문에, 이러한 질병은 독점적 인 모유 수유에 의해 크게 감소, HIV에 감염된 어머니에게 혜택 모유 수유는 위험13,14,15보다훨씬 큽니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된산모16에대한 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM을 통해 대략 100,000 선교사 훈련원은 매년 발생합니다; 아직, HIV에 감염된 산모에 의해 모유수유를 한 유아의 ~15%만이 감염되어 BM17,18,19,20,21의강력한 보호 효과를 시사한다. 수많은 요인이 전송을 방지하기 위해 함께 작동 할 가능성이 높습니다. 중요한 것은, BM에 있는 HIV 특정 항체 (Abs)는 HIV 감염22,23에서감소된 MTCT 및/또는 감소된 유아 죽음과 상관되었습니다. 크게 불분명 남아 있는 것은 그것의 항 바이러스 자질에 BM의 세포 분획의 기여.
많은 Abs는 면역 글로불린 분자의 ‘일정한’ 영역에 의해 매개되는 다양한 항 바이러스 활동을 촉진하며, 결정화 가능한 단편(Fc)은 사실상 모든 선천성 면역 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcRs)와의 상호작용을 통해 사실상 모든 항바이러스 작용을 촉진합니다. 인간 BM24에서발견된다. 항체 의존성 세포 식세포증(ADCP)은 바이러스 감염의 허가를 위해 필요에 따라입증되었으며 HIV25,26,27의MTCT 예방의 경우 과소 연구되어왔다. 28세 , 29. HIV의 MTCT 예방에 BM 식세포에 의한 ADCP 활동의 잠재적 기여에 대한 지식의 빈약함을 감안할 때, 우리는 세포에 의해 매개 된 ADCP의 연구를 수행하기 위해 인간 BM에서 세포를 분리하는 엄격한 방법을 개발하는 것을 목표로했습니다. BM은 수유의 다양한 단계에서 얻은.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 ADCP 활성을 측정하기 위한 유세포 분석 기반 기술은 2011년30년에 처음 기술되었으며, 이후 80개 이상의 연구에서 견고하게 입증되고 인용되었다. 여기에 설명된 프로토콜은 이 기술을 1차 BM 세포와 처음으로 사용하기 위해 적응합니다. BM 세포에 의한 Fc 매개 기능의 이전 연구는 초유로부터 분리된 세포를 사용하여 산화 파열 또는 장기학 기반 식세포 분석법의 측정…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고 검토를 위해 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학의 의학 및 미생물학과에서 수잔 졸라 – 파즈너 박사에게 감사드립니다. NIH/NICHD는 보조금 번호 R21 HD095772-01A1에 따라 이 프로젝트에 대한 자금을 제공했습니다. 또한, R. 파월은 시나이 산의 이칸 의과 대학, 감염증 학과의 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
Riferimenti
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
