Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Test für die Charakterisierung der Lipidtröpfchenbildung (LD) bei menschlichen Darmorganoiden bei Stimulation mit Fettsäuren. Wir diskutieren, wie dieser Assay für die Quantifizierung der LD-Bildung verwendet wird, und wie er für ein Hochdurchsatz-Screening für Medikamente verwendet werden kann, die die LD-Bildung beeinflussen.
Abstract
Diätetische Lipide werden vom Darmepithel als freie Fettsäuren (FAs) aufgenommen. Diese FAs werden intrazellulär in Triglyceridmoleküle (TG) umgewandelt, bevor sie in Chylomikron für den Transport zur Lymphe oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) zur intrazellulären Lagerung verpackt werden. Ein entscheidender Schritt für die Bildung von LDs ist die katalytische Aktivität von Diacylglycerol-Acyltransferasen (DGAT) im letzten Schritt der TG-Synthese. LDs sind wichtig, um toxische Lipidarten zu puffern und den Zellstoffwechsel in verschiedenen Zelltypen zu regulieren. Da das menschliche Darmepithel regelmäßig mit hohen Lipidkonzentrationen konfrontiert wird, ist die LD-Bildung von großer Bedeutung, um die Homöostase zu regulieren. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur Charakterisierung und Quantifizierung der LD-Bildung (LDF) bei Stimulation mit der häufigsten ungesättigten Fettsäure, Ölsäure, bei menschlichen Darmorganoiden. Der LDF-Test basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD540, der die Quantifizierung von LDs durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie ermöglicht. Der LDF-Assay kann verwendet werden, um die LD-Bildung in menschlichen Darmepithelzellen zu charakterisieren oder menschliche (genetische) Störungen zu untersuchen, die den LD-Stoffwechsel beeinflussen, wie DGAT1-Mangel. Darüber hinaus kann dieser Assay auch in einer Hochdurchsatz-Pipeline verwendet werden, um neuartige therapeutische Verbindungen zu testen, die Defekte in der LD-Bildung bei Darm- oder anderen Organoiden wiederherstellen.
Introduction
Lipide sind ein entscheidender Bestandteil der menschlichen Ernährung und spielen eine wichtige Rolle bei der systemischen Energiespeicherung und dem Stoffwechsel. Bei der Aufnahme werden diätetische Lipide durch Bauchspeicheldrüsenlipasen zu freien Fettsäuren (FFAs) und Monoglyceriden (MGs) abgebaut. Diese Substrate werden dann von den Enterozyten des Darmepithels aufgenommen, wo sie zunächst durch Monoglycerid-Acyltransferasen (MGAT)-Enzyme zu Diglyceriden (DG) und anschließend zu Triglyceriden (TG) durch Diacylglycerin reesterifiziert werden. Acyltransferase 1 (DGAT1)1. Schließlich sind diese TGs entweder in Chylomicrons für den Export in das Lymphsystem oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) für die intrazelluläre Lagerung2,3integriert. Obwohl Chylomicronen benötigt werden, um diätetische Lipide auf andere Organe zu verteilen, ist die Bedeutung der intrazellulären Fettspeicherung in LDs nicht ganz klar. Jedoch, LDs haben gezeigt, dass eine regulatorische Funktion im Darm zu erfüllen, wie sie langsam Lipide in den Kreislauf bis zu 16 h nach einer Mahlzeit4freisetzen. Darüber hinaus haben lDs gezeigt, dass sie vor toxischen Fettsäurekonzentrationen schützen, wie z. B. bei Mausadipozyten unter lipolytischen Bedingungen5.
Das DGAT1-Protein befindet sich auf der endoplasmatischen Retikulummembran (ER) und spielt eine entscheidende Rolle bei der LD-Bildung im Darmepithel. Homozygote Mutationen in DGAT1 führen zu früh auftretendem schweren Durchfall und/oder Erbrechen, Hypoalbuminämie und/oder (tödlicher) Proteinverlust-Enteropathie mit Darmversagen bei Fettaufnahme, was die Bedeutung von DGAT1 bei der Lipidhomöostase des Menschen Darmepithel6,7,8,9,10. Da das Auftreten von DGAT1-Mangel beim Menschen selten ist, ist der Zugang zu primären, vom Patienten abgeleiteten Zellen nur knapp. Darüber hinaus ist die Langzeitkultur der Darmepithelzellen seit langem auf tumorabgeleitete Zelllinien beschränkt, die die normale Physiologie nur bedingt darstellen. Daher wurde die DGAT1-vermittelte LD-Bildung meist in Fibroblasten oder tierischen Zelllinien7,10,11,12untersucht. Als solche wurde kürzlich gezeigt, dass DGAT1-defizienten Patienten-abgeleiteten Fibroblasten weniger LDs ansammeln als gesunde Kontrollzellen nach Stimulation mit Ölsäure (OA)8.
Zuvor wurden Protokolle zur Kultur epitheliale Stammzellen aus jedem Magen-Darm-Organ in Form von dreidimensionalen (3D) Organoiden13etabliert. Diese Darmorganoide können über einen längeren Zeitraum13in kulturerhalten und ermöglichen die funktionelle Untersuchung patienten- und darmortspezifischer Epithelmerkmale14. Sie sind genetisch und phänotypisch stabil und können gelagert werden, was eine langfristige Expansion und Biobanking13ermöglicht.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass LD-Bildung leicht in menschlichen Darmorganoiden in einem LD-Formationstest (LDF) Assay6gemessen werden kann. Wenn sie OA für 16 h ausgesetzt sind, erzeugen Organoide LDs, um die Zellen vor lipidinduzierter Toxizität zu schützen. Wenn die OA-Konzentrationen zu hoch sind, sterben die Zellen durch Caspase-vermittelte Apoptose6ab. Der LDF-Test war zuvor weitgehend von DGAT1 abhängig, wie durch Organoide von DGAT1-mutierten Patienten und durch die Verwendung von DGAT1-spezifischen Inhibitoren6angezeigt wurde.
Für den hier ausführlich beschriebenen LDF-Assay werden 3D-Organoide aus Darmbiopsien kultiviert und wöchentlich durch Unterbrechung in einzelne Zellen geleitet, die leicht neue Organoide bilden. Für den LDF-Assay werden in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte 7.500 organoidabgeleitete Einzelzellen plattiert. Organoide werden über mehrere Tage gebildet, über Nacht mit 1 mM OA inkubiert und mit LD540, einem fluoreszierenden zelldurchlässigen LD-spezifischen Farbstoff, der die Bildgebung erleichtert, gebeizt. Die LD-Bildung wird dann durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie quantifiziert.
Durch die Skalierung dieses LD-Formationstests auf ein 96-Well-Format kann der Assay auch für die Hochdurchsatzanalyse der LD-Bildung verwendet werden, um neuartige Medikamente zu untersuchen, die die LD-Bildung in menschlichen Darmorganoidkulturen beeinflussen, oder um (menschliche genetische) Störungen zu untersuchen, die LD-Stoffwechsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Bestimmung der LD-Bildung bei menschlichen Darmorganoiden bei der Inkubation mit Ölsäure zur Verfügung. Diese Methode basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD54018, der eine Charakterisierung und Quantifizierung des Gesamtvolumens von Lipidtröpfchen innerhalb einer organoiden Kultur ermöglicht. Die Verfahren zur Etablierung und Erhaltung menschlicher Darmorganoidkulturen wurden vor13veröffentlicht, und ein visueller Le…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken B. Spee für die großzügige Bereitstellung von LD540. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) an S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
Riferimenti
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