En fluorescens-baseret assay til karakterisering og kvantificering af lipid-Dråbedannelse i humane tarm Organoider
Summary
Denne protokol beskriver en analyse til karakterisering af lipid dråbe (LD) dannelse i humane intestinale organoider ved stimulation med fedtsyrer. Vi diskuterer, hvordan denne analyse bruges til kvantificering af LD dannelse, og hvordan det kan bruges til høj gennemløbs screening for lægemidler, der påvirker LD dannelse.
Abstract
Kosten lipider er taget op som frie fedtsyrer (FAs) af tarm epitelet. Disse FAs er intracellulært omdannet til triglycerid (TG) molekyler, før de er pakket ind i chylomikroner til transport til lymfeknuder eller i cytosolisk lipid dråber (LDs) til intracellulære opbevaring. Et afgørende skridt for dannelsen af LDs er den katalytiske aktivitet af vegetabilsk diacylglycerololie acyltransferaser (DGAT) i det sidste trin af TG-syntesen. LDs er vigtigt at buffer giftige lipidarter og regulere cellulære metabolisme i forskellige celletyper. Da det humane tarm epitelet jævnligt konfronteres med høje koncentrationer af lipider, er LD formation af stor betydning for at regulere homøostase. Her beskriver vi en simpel assay til karakterisering og kvantificering af LD formation (LDF) ved stimulation med den mest almindelige umættede fedtsyrer, oliesyre, i humane intestinale organoider. LDF-analysen er baseret på det LD-specifikke fluorescerende farvestof LD540, som giver mulighed for kvantificering af LDs ved Konfokal mikroskopi, fluorescerende plade læser eller flowcytometri. LDF-analysen kan anvendes til at karakterisere LD dannelse i humane tarm epiteliale celler eller til at studere humane (genetiske) lidelser, der påvirker LD metabolisme, såsom DGAT1 mangel. Desuden kan denne analyse også anvendes i en høj-gennemløb rørledning til at teste nye terapeutiske forbindelser, som genoprette defekter i LD dannelse i tarm eller andre typer af organoider.
Introduction
Lipider er en afgørende bestanddel af den menneskelige kost og spiller en vigtig rolle i systemisk energilagring og metabolisme. Når indtages, kosten lipider nedbrydes til frie fedtsyrer (FFAs) og monoglycerider (MGs) af bugspytkirtlen lipases. Disse substrater tages derefter op af enterocytterne i tarm Epitelet, hvor de først re-esterificeret til diglycerider (DG) ved i acyltransferaser (mgat) enzymer og efterfølgende til triglycerider (TG) af vegetabilsk diacylglycerololie acyltransferase 1 (DGAT1)1. Endelig, disse TGS er integreret i enten chylomikroner til eksport til lymfesystemet eller cytosolisk lipid dråber (LDs) for intracellulære opbevaring2,3. Selvom chylomikroner er nødvendige for at distribuere lipider med kosten til andre organer, er betydningen af intracellulær fedt oplagring i LDs ikke helt klar. Men LDs har vist sig at udføre en regulerende funktion i tarmen, da de langsomt frigiver lipider i cirkulation op til 16 timer efter et måltid4. Desuden har LDs vist sig at beskytte mod giftige fedtsyrer koncentrationer, såsom i mus adipocytter under lipolytiske betingelser5.
DGAT1-proteinet er placeret på endoplasmatiske reticulum (er) membranen og spiller en afgørende rolle i ld dannelse i tarm epitelet. Homozygot mutationer i DGAT1 føre til tidlig debut svær diarré og/eller opkastning, hypoalbuminæmi, og/eller (fatal) protein-tabende enteropati med tarm svigt på fedt indtag, illustrerer betydningen af DGAT1 i lipid homøostase af den menneskelige tarm epitelet6,7,8,9,10. Da forekomsten af DGAT1-mangel hos mennesker er sjælden, har adgang til primære patient-afledte celler været knappe. Endvidere, den langsigtede kultur af tarm epiteliale celler har længe været begrænset til tumor-afledte cellelinjer, som repræsenterer den normale fysiologi kun til en begrænset udvidelse. Derfor er DGAT1-medieret ld formation for det meste blevet undersøgt i fibroblaster eller dyr-afledte cellelinjer7,10,11,12. Som sådan, det blev for nylig påvist, at DGAT1-mangelfuld patient-afledte fibroblaster akkumulere mindre LDs sammenlignet med raske kontrol celler efter stimulation med oliesyre (OA)8.
Tidligere blev der etableret protokoller til kultur epiteliale stamceller fra alle gastrointestinale organer i form af tredimensionale (3D) organoider13. Disse intestinale organoider kan holdes i kultur i en lang periode af tid13, og tillade funktionelle undersøgelse af patient-og tarm placering-specifikke epiteliale karakteristika14. De er genetisk og fænotypisk stabile og kan lagres, tillader langsigtet ekspansion og biobanking13.
Vi har for nylig påvist, at LD dannelse let kan måles i humane intestinale organoider i en LD formation (LDF) assay6. Når de udsættes for OA for 16 timer, genererer organoider LDs for at beskytte cellerne mod lipid-induceret toksicitet. Når OA koncentrationer er for høje, cellerne dør af caspase-medieret apoptose6. LDF-analysen blev tidligere påvist at være stort set afhængig af DGAT1 som angivet af organoider afledt af DGAT1-mutant patienter og ved anvendelse af DGAT1-specifikke hæmmere6.
For ldf-analysen, der er beskrevet i detaljer her, dyrkes 3D-organoider fra intestinale biopsier og er urerne ugentligt ved afbrydelse i enkeltceller, der nemt danner nye organoider. For at køre LDF-analysen er ~ 7.500 organoid-afledte enkeltceller belagt i hver brønd af en 24-brønd plade. Organoider dannes over flere dage, inkuberet natten over med 1 mM OA og farves med LD540, en fluorescerende celle-permeable LD-specifikke farvestof, der letter billeddannelse. LD-dannelsen kvantificeres derefter ved Konfokal mikroskopi, fluorescerende plade læser eller strømnings cytometri.
Ved at skalere denne LD formation assay til en 96-brønd format, kan analysen også anvendes til high-gennemløb analyse af LD dannelse til skærmen for nye lægemidler, som påvirker LD dannelse i humane tarm organoid kulturer, eller at studere (menneskelige genetiske) lidelser, der påvirker LD metabolisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her giver vi en protokol til bestemmelse af LD dannelse i humane intestinale organoider ved inkubation med oliesyre. Denne metode er baseret på LD-specifikke fluorescerende farvestof LD54018, som giver mulighed for karakterisering og kvantificering af den samlede mængde af lipid dråber i en organoid kultur. Procedurerne for at etablere og vedligeholde humane tarm organoide kulturer er blevet offentliggjort før13, og en visuel vejledning af denne protokol er tilgængelig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker B. Spee for generøst at give LD540. Dette arbejde blev støttet af en nederlandsk organisation for videnskabeligt forskningstilskud (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) til S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
Riferimenti
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
