Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos
Summary
Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.
Abstract
Los lípidos dietéticos son tomados como ácidos grasos libres (FAs) por el epitelio intestinal. Estos FA se convierten intracelularmente en moléculas de triglicéridos (TG), antes de que se envasen en quilomicrones para su transporte a la linfa o en gotas de lípidos citosólicos (LD) para el almacenamiento intracelular. Un paso crucial para la formación de LOS LU es la actividad catalítica de las aciltransferasas diacilglicerol (DGAT) en el paso final de la síntesis de TG. Los D.M. son importantes para amortiguar las especies de lípidos tóxicos y regular el metabolismo celular en diferentes tipos de células. Dado que el epitelio intestinal humano se enfrenta regularmente con altas concentraciones de lípidos, la formación de LD es de gran importancia para regular la homeostasis. Aquí describimos un simple ensayo para la caracterización y cuantificación de la formación de LD (LDF) sobre la estimulación con el ácido graso insaturado más común, el ácido oleico, en los organoides intestinales humanos. El ensayo LDF se basa en el tinte fluorescente LD540 específico de LD, que permite cuantificar los D mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo. El ensayo LDF se puede utilizar para caracterizar la formación de LD en células epiteliales intestinales humanas, o para estudiar trastornos humanos (genéticos) que afectan el metabolismo de la LD, como la deficiencia de DGAT1. Además, este ensayo también se puede utilizar en una tubería de alto rendimiento para probar nuevos compuestos terapéuticos, que restauran defectos en la formación de LD en los órganooides intestinales u otros tipos.
Introduction
Los lípidos son un componente crucial de la dieta humana y juegan un papel importante en el almacenamiento de energía sistémica y el metabolismo. Cuando se ingenian, los lípidos dietéticos se degradan en ácidos grasos libres (FFA) y monoglicéridos (GM) por lipasas pancreáticas. Estos sustratos son entonces tomados por los enterocitos del epitelio intestinal, donde primero son reesterificados a diglicéridos (DG) por enzimas aciltransferasas monoglicéridos (MGAT) y posteriormente a triglicéridos (TG) por diacilglicerol acitransferasa 1 (DGAT1)1. Por último, estos TG s están integrados en quilomicrones para su exportación al sistema linfático o gotas lipídicas citosólicas (LD) para el almacenamiento intracelular2,3. Aunque se necesitan quilomicrones para distribuir lípidos dietéticos a otros órganos, la importancia del almacenamiento de grasa intracelular en los D No está completamente clara. Sin embargo, se ha demostrado que los DN realizan una función reguladora en el intestino, ya que liberan lentamente lípidos en la circulación hasta 16 h después de una comida4. Además, se ha demostrado que los LU protegen contra las concentraciones de ácidos grasos tóxicos, como en los adipocitos de ratón durante condiciones lililíticas5.
La proteína DGAT1 se encuentra en la membrana del retículo endoplasmático (ER) y desempeña un papel crucial en la formación de LD en el epitelio intestinal. Las mutaciones homocigotas en DGAT1 conducen a diarrea y/o vómitos graves de inicio temprano, hipoalbuminemia y/o enteropatía (fatal) que pierde proteínas con insuficiencia intestinal al tener grasa, lo que ilustra la importancia de DGAT1 en la homeostasis lipídica del ser humano epitelio intestinal6,7,8,9,10. Dado que la aparición de deficiencia de DGAT1 en humanos es poco frecuente, el acceso a las células primarias derivadas del paciente ha sido escaso. Además, el cultivo a largo plazo de las células epiteliales intestinales se ha restringido durante mucho tiempo a las líneas celulares derivadas de tumores que representan la fisiología normal sólo a una extensión limitada. Por lo tanto, la formación de LD mediada por DGAT1 se ha estudiado principalmente en fibroblastos o líneas celulares de origen animal7,10,11,12. Como tal, recientemente se demostró que los fibroblastos derivados del paciente con deficiencia de DGAT1 acumulan menos LDs en comparación con las células de control sanas después de la estimulación con ácido oleico (OA)8.
Anteriormente, se establecieron protocolos para cultivar células madre epiteliales de cualquier órgano gastrointestinal en forma de organoides tridimensionales (3D)13. Estos organoides intestinales se pueden mantener en cultivo durante un largo período de tiempo13,y permiten el estudio funcional de las características epiteliales específicas del paciente e intestinal14. Son genética y fenotípicamente estables y pueden almacenarse, permitiendo la expansión a largo plazo y la biobanca13.
Recientemente demostramos que la formación de LD se puede medir fácilmente en organoides intestinales humanos en un ensayo de formación de LD (LDF)6. Cuando se exponen a OA durante 16 h, los organoides generan LDs para proteger las células de la toxicidad inducida por lípidos. Cuando las concentraciones de OA son demasiado altas, las células mueren por apoptosis mediada por caspasa6. Anteriormente se demostró que el ensayo LDF dependía en gran medida de DGAT1, como indican los organoides derivados de pacientes con mutantes DGAT1 y el uso de inhibidores específicos de DGAT16.
Para el ensayo de LDF descrito en detalle aquí, los organoides 3D se cultivan a partir de biopsias intestinales y se reperduen semanalmente por la interrupción en células individuales que forman fácilmente nuevos organoides. Para ejecutar el ensayo de LDF, se celen células individuales derivadas de organoides de 7.500 euros en cada pocal de una placa de 24 pocillos. Los organoides se forman durante varios días, se incuban durante la noche con 1 mM de OA y se tiñen con LD540, un tinte específico para LD permeable a las células fluorescentes que facilita la toma de imágenes. La formación de LD se cuantifica entonces mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo.
Al escalar este ensayo de formación de LD a un formato de 96 pozos, el ensayo también se puede utilizar para el análisis de alto rendimiento de la formación de LD para detectar nuevos fármacos que afectan a la formación de LD en cultivos organoides intestinales humanos, o para estudiar trastornos (genéticos humanos) que afectan Metabolismo de la LD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, proporcionamos un protocolo para determinar la formación de LD en organoides intestinales humanos tras la incubación con ácido oleico. Este método se basa en el tinte fluorescente específico ld 54018,que permite la caracterización y cuantificación del volumen total de gotas lipídicas dentro de un cultivo organoide. Los procedimientos para establecer y mantener los cultivos organoides intestinales humanos se han publicado antes de13, y una guía visual de este…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a B. Spee por proporcionar generosamente LD540. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) a S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
Riferimenti
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
