Un saggio basato sulla fluorescenza per la caratterizzazione e la quantificazione della formazione di gocciolini di lipidi negli organiidi intestinali umani
Summary
Questo protocollo descrive un saggio per la caratterizzazione della formazione di goccioline lipidi (LD) negli organoidi intestinali umani dopo la stimolazione con acidi grassi. Discutiamo di come questo saggio viene utilizzato per la quantificazione della formazione di LD, e come può essere utilizzato per lo screening ad alta produttività per i farmaci che influenzano la formazione di LD.
Abstract
I lipidi dietetici sono assunti come acidi grassi liberi (FU) dall’epitelio intestinale. Queste FA sono convertite intracellulare in molecole di trigliceridi (TG), prima di essere confezionate in chylomicron per il trasporto alla linfa o in goccioline lipidiche citosoliche (LD) per lo stoccaggio intracellulare. Un passo cruciale per la formazione dei LD è l’attività catalitica degli acylglycerol acyltransferases (DGAT) nella fase finale della sintesi TG. Gli LD sono importanti per tamponare le specie di lipidi tossiche e regolare il metabolismo cellulare in diversi tipi di cellule. Poiché l’epitelio intestinale umano si confronta regolarmente con alte concentrazioni di lipidi, la formazione di LD è di grande importanza per regolare l’omeostasi. Qui descriviamo un semplice saggio per la caratterizzazione e la quantificazione della formazione di LD (LDF) sulla stimolazione con l’acido grasso insaturi più comune, l’acido oleico, negli organoidi intestinali umani. L’analisi LDF si basa sul colorante fluorescente LD LD, che consente la quantificazione degli LD mediante microscopia confocale, lettore di lastre fluorescenti o citometria a flusso. L’analisi LDF può essere utilizzata per caratterizzare la formazione di LD nelle cellule epiteliali intestinali umane, o per studiare disturbi umani (genetici) che influenzano il metabolismo dell’LD, come la carenza di DGAT1. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato anche in una pipeline ad alta produttività per testare nuovi composti terapeutici, che ripristinano i difetti nella formazione di LD in intestinali o altri tipi di organoidi.
Introduction
I lipidi sono una componente cruciale della dieta umana e svolgono un ruolo importante nello stoccaggio e nel metabolismo dell’energia sistemica. Quando ingeriti, i lipidi dietetici vengono degradati in acidi grassi liberi (FFA) e monogliceridi (MG) da lipasi pancreatici. Questi substrati vengono poi assorbiti dagli enterociti dell’epitelio intestinale, dove vengono prima ri-esterismi a diglycerides (DG) da enzimi di aciltrasferidi monoglicetri (MGAT) e successivamente ai trigliceridi (TG) dal diacilglicerolo acyltransferase 1 (DGAT1)1. Infine, questi TG sono integrati in chilomicroni per l’esportazione nel sistema linfatico o goccioline lipidici citosoliche (LD) per l’immagazzinamento intracellulare2,3. Anche se i chilomicron sono necessari per distribuire i lipidi dietetici ad altri organi, l’importanza dell’immagazzinamento di grasso intracellulare nelle LD non è completamente chiara. Tuttavia, gli LD hanno dimostrato di svolgere una funzione regolatore nell’intestino, in quanto rilasciano lentamente i lipidi nella circolazione fino a 16 h dopo un pasto4. Inoltre, gli LD hanno dimostrato di proteggere contro le concentrazioni di acidi grassi tossici, come negli adipociti del topo durante le condizioni lipolisite5.
La proteina DGAT1 si trova sulla membrana del reticolo endoplasmico (ER) e svolge un ruolo cruciale nella formazione di LD nell’epitelio intestinale. Le mutazioni omozygose nel DGAT1 portano a diarrea grave e/o vomito, ipoalbuminemia e/o enteropatia (fatale) di proteine con insufficienza intestinale all’assunzione di grassi, illustrando l’importanza del DGAT1 nell’omeostasi lipidica dell’uomo epitelio intestinale6,7,8,9,10. Poiché il verificarsi di carenza di DGAT1 negli esseri umani è raro, l’accesso alle cellule primarie derivate dal paziente è stato scarso. Inoltre, la coltura a lungo termine delle cellule epiteliali intestinali è stata a lungo limitata alle linee cellulari derivate dal tumore che rappresentano la fisiologia normale solo in misura limitata. Pertanto, la formazione di LD mediata da DGAT1 è stata studiata principalmente nei fibroblasti o nelle linee cellulari di origine animale7,10,11,12. Come tale, è stato recentemente dimostrato che i fibroblasti derivati dal paziente Degrado di DGAT1 accumulano meno LD rispetto alle cellule di controllo sane dopo la stimolazione con acido oleico (OA)8.
In precedenza, sono stati stabiliti protocolli per coltura cellule staminali epiteliali da qualsiasi organo gastrointestinale sotto forma di organoidi tridimensionali (3D)13. Questi organoidi intestinali possono essere tenuti in coltura per un lungo periodo di tempo13, e consentire lo studio funzionale delle caratteristiche epiteliali specifiche del paziente e del luogo intestinale14. Sono geneticamente e fenotipicamente stabili e possono essere immagazzinati, consentendo l’espansione a lungo termine e il biobanking13.
Recentemente abbiamo dimostrato che la formazione di LD può essere facilmente misurata negli organoidi intestinali umani in un assaggioLD(LDF) 6 . Quando esposti a OA per 16 h, gli organoidi generano LD per proteggere le cellule dalla tossicità indotta dai lipidi. Quando le concentrazioni di OA sono troppo elevate, le cellule muoiono per apoptosi mediata dalla caspasi6. Il saggio LDF è stato precedentemente dimostrato essere in gran parte dipendente dal DGAT1 come indicato dagli organoidi derivati da pazienti mutanti DGAT1 e dall’uso di inibitori specifici di DGAT16.
Per il saggio LDF descritto in dettaglio qui, gli organoidi 3D sono coltivati da biopsie intestinali e vengono passati settimanalmente da interruzioni in singole cellule che formano facilmente nuovi organoidi. Per l’esecuzione del saggio LDF, 7.500 celle singole derivate da organoidi sono placcate in ogni pozzo di una piastra di 24 pozze. Gli organiidi si formano nel corso di diversi giorni, incubati durante la notte con 1 mM OA e macchiati con LD540, un coloranti fluorescente specifico per le cellule LD che facilita l’imaging. La formazione di LD viene quindi quantificata mediante microscopia confocale, lettore di piastre fluorescenti o citometria a flusso.
Scalando questo saggio di formazione LD in un formato di 96 pozzi, l’analisi può essere utilizzato anche per l’analisi ad alta velocità della formazione di LD per lo screening di nuovi farmaci che influenzano la formazione di LD nelle colture organoidi intestinali umane, o per studiare disturbi (genetici umani) che colpiscono metabolismo LD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, forniamo un protocollo per determinare la formazione di LD negli organoidi intestinali umani in caso di incubazione con acido oleico. Questo metodo si basa sul coloranti fluorescente LD54018specifico di LD, che consente la caratterizzazione e la quantificazione del volume totale delle goccioline lipidiche all’interno di una coltura organoide. Le procedure per stabilire e mantenere le colture organoide intestinali umane sono state pubblicate prima delle13,ed è disponib…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo B. Spee per aver generosamente fornito LD540. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell’Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-eonMW; VIDI 016.146.353) a S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
Riferimenti
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