从胚胎小鼠小脑分离的神经元的主要培养
Summary
进行体外实验以尽可能充分地反映体内状况并非易事。使用原发细胞培养物是了解整个生物体中细胞生物学的重要一步。提供的协议概述了如何成功生长和培养胚胎小鼠小脑神经元。
Abstract
使用原发性细胞培养物已成为研究体外神经系统的主要工具之一。使用这种简化的模型系统的最终目标是提供受控的微环境，并在体外条件下尽可能保持分离神经元和非神经元细胞的高存活率和自然特征。在本文中，我们演示了一种将原神经元与发育中的小鼠小脑分离的方法，将它们置于体外环境中，确定其生长，并监测其生存能力和分化数周。该方法适用于胚胎间12-18之间与小脑分离的胚胎神经元。
Introduction
几十年来，细胞系在临床前研究和生物学研究中被广泛用作高通量工具。成本效益高、生长快和减少活体动物使用是使用这些细胞的一些好处。然而，基因改变和现象变化积累后，在体外几次通道1。细胞系的误认和原发细胞的遗传差异会导致不可重复的实验和错误的结论2，3，4，5。因此，尽管与分化的细胞（如神经元（如神经递质、电道、受体和其他神经元特异性蛋白质）有一些相似之处，但神经元细胞系无法复制神经元的全部表型。使用成熟的神经元是另一种选择;然而，这些细胞是非分裂的后密细胞，很难在培养中繁殖。此外，重新进入细胞周期可能沉淀凋亡6。
三维 （3D） 细胞培养、组织切片培养和有机体培养物培养已经开发出来，以提供一个环境，使细胞可以排列成模仿体内环境的 3D 形式。因此，可以研究细胞与细胞的沟通、迁移、肿瘤细胞侵入周围组织以及血管生成。然而，使用额外的细胞基质（ECM）蛋白质或合成水凝胶作为床上用品的额外费用、成像难度以及与高通量筛选仪器的兼容性是3D细胞培养的相当缺点。器官组织切片培养的一个主要缺点是使用大量的动物和斧头的不良影响，这导致无法获取轴xons的目标和生长因子，从而导致神经元死亡8。
因此，另一种避免细胞系问题、成熟细胞生长困难和组织复杂性的另一种方法是未成熟的原细胞在体外成熟。原细胞直接来自人类或动物组织，并使用酶和/或机械方法分离9。无论组织来源如何，培养培养基中分离、播种和维护的主要原理都相似。然而，促进增殖和成熟所必需的营养因子是高度细胞特异性6。
了解每个小脑细胞类型的”出生日期”是设计初级培养实验的先决条件。一般来说，Purkinje细胞（PC）和小脑细胞核（CN）的神经元在较小的细胞之前出生，包括内神经元（如篮子、硬质细胞）和颗粒细胞。在小鼠中，PC 在胚胎日 （E）10_E13 之间出现，而 CN 神经元在大约 E9_E1210之间出现。
其他小脑神经元的出生时间要晚得多。例如，在小鼠中，内神经元的Golgi亚群由VZ在（+E14+E18）生成，分子层中剩余的内神经元（篮子细胞和硬质细胞）从早期白质中的祖细胞分裂出来产后 （P）0=P711.颗粒细胞产生于外部生殖区（EGZ），这是一个从红斑唇衍生的次生菌区，出生后通过终端分裂。但是，在它们的前体从E13_E16的菱形唇出现之前，细胞已经沿着pia表面沿皮面沿波拉迁移，在小脑的背表面产生一层薄薄的细胞。非神经性巨胶质细胞，如星形细胞和寡核苷酸细胞，起源于心室神经皮皮，分别诞生于E13.5+P0和P0+P7，分别为11、12、13、14 ， 15.微胶质来自E8+E10之间的蛋黄囊原始骨髓祖细胞，入侵中枢神经系统后可以通过E916在小鼠大脑中检测到。
本文介绍的方法基于Furuya等人和Tabata等人最初开发的方法，即17、18，该方法针对从威斯塔大鼠Cerebella衍生的Purkinje细胞进行初级培养进行了优化。我们现在已经适应了这种方法，并仔细修改了它，以研究小鼠小脑神经元的生长19。与新协议不同，冷解剖介质是在Furuya协议17中添加播种介质之前，在解剖和分离步骤中使用的主要洗涤缓冲液。此缓冲液缺乏营养、生长因子和激素（所有在 Dulbecco 的改良 Eagle 介质中：营养混合物 F-12 [DMEM/F12]）是支持上述步骤中细胞生长和存活所必需的。此外，根据我们对鼠原小脑培养的丰富经验，我们在每个井中使用了500μL的培养基（而不是1 mL），并将三碘氨酸浓度提高到0.5纳克/mL，从而改善神经元细胞的生长。尤其是那些具有Purkinje细胞表型，并促进培养中树突状分支的生长。本文介绍的主要方法可广泛应用于胚胎发育过程中的其他小啮齿动物（如松鼠和仓鼠），并可用于研究不同胚胎阶段的小啮齿动物神经发生和分化，不同物种。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用初级培养物是一种众所周知的方法，适用于所有类型的神经元17，18，19。在提出的协议中，我们解释如何分离小脑神经元，并保持其生存能力与最佳生存在体外最多3周。在E15+E18中分离的小脑细胞的主要培养，证实了三类大神经元的集合：PC、Golgi细胞和CN。在培养19、21的21天内?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这些研究得到了自然科学和工程研究理事会（HM：NSERC发现赠款 –RGPIN-2018-06040）和马尼托巴儿童医院研究所（HM：格兰特#320035）和ALS加拿大-脑加拿大Arthur J的资助。哈德逊翻译团队格兰特（JK，HM）。
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
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