Primær kultur af neuroner isoleret fra embryonale mus cerebellum
Summary
Gennemførelse in vitro forsøg til at afspejle in vivo betingelser så tilfredsstillende som muligt er ikke en let opgave. Brugen af primær cellekulturer er et vigtigt skridt i retning af at forstå cellebiologi i en hel organisme. Den medfølgende protokol skitserer, hvordan man med held vokse og kultur embryonale mus cerebellar neuroner.
Abstract
Brugen af primære cellekulturer er blevet et af de vigtigste værktøjer til at studere nervesystemet in vitro. Det ultimative mål med dette forenklede model system er at give et kontrolleret mikromiljø og opretholde den høje overlevelsesrate og de naturlige træk ved dissocierede neuronal og nonneuronal celler så meget som muligt under in vitro-betingelser. I denne artikel, vi demonstrere en metode til at isolere primære neuroner fra at udvikle musen cerebellum, placere dem i et in vitro-miljø, etablering af deres vækst, og overvågning af deres levedygtighed og differentiering i flere uger. Denne metode gælder for embryonale neuroner dissocieret fra cerebellum mellem embryonale dage 12 – 18.
Introduction
I flere årtier, cellelinjer har været meget anvendt som en høj gennemløb værktøj i prækliniske undersøgelser og biologisk forskning. Omkostningseffektivitet, hurtig vækst, og reduktion af levende dyr brug er nogle fordele ved at bruge disse celler. Imidlertid akkumuleres genetiske forandringer og fænotypiske ændringer efter flere passager in vitro1. Fejlidentifikation af cellelinjer og genetisk dissimilaritet fra primære celler kan føre til irreproducerbare eksperimenter og falske konklusioner2,3,4,5. Derfor, på trods af nogle ligheder med differentierede celler såsom neuroner (f. eks neurotransmittere, Ion kanaler, receptorer, og andre neuron-specifikke proteiner), neuronal cellelinjer kan ikke replikere den fulde fænotype af neuroner. Ved hjælp af modne neuroner er en anden mulighed; men disse celler er ikke-dividere postmitotiske celler, der er vanskelige at udbrede i kulturen. Desuden kan genindførsel i cellecyklussen udløse apoptose6.
Tredimensionelle (3D) cellekultur, organotypiske skive kulturer, og organoid kulturer er blevet udviklet til at give et miljø, hvor cellerne kan arrangere i en 3D-form, der efterligner in vivo-indstillingen. Således celle-til-celle kommunikation, migration, invasion af tumorceller i omgivende væv, og angiogenese kan undersøgt7. Men, ekstra omkostninger ved at bruge ekstracellulære matrix (ECM) proteiner eller syntetiske silicagelrogeler som en strøelse, problemer med billeddannelse, og kompatibilitet med High-gennemløb screening instrumenter er betydelige ulemper ved 3D-celledyrkning. En væsentlig ulempe ved organotypic vævs skive kultur er brugen af et stort antal dyr og de negative virkninger af axotomi, hvilket fører til manglende adgang til mål og vækstfaktorer for axons, og dermed neuronal død8.
Derfor er en alternativ tilgang, som undgår problemer med cellelinjer, vanskeligheden ved at dyrke modne celler, og kompleksiteten af væv, er in vitro modning af umodne primære celler. Primær cellerne udledes direkte fra humane eller animalske væv og adskilles ved hjælp af enzymatiske og/eller mekaniske metoder9. De vigtigste principper for isolation, såning, og vedligeholdelse i kulturmedium er ens uanset vævs kilden. Men de trofiske faktorer, der er nødvendige for at fremme spredning og modning er meget celle specifikke6.
At kende “fødselsdato” for hver cerebellare celletype er en forudsætning for at designe et primært kultur eksperiment. I almindelighed, Purkinje celler (PCs) og neuroner i cerebellare kerner (CN), er født før de mindre celler, herunder interneuroner (f. eks, kurv, stellate celler) og granulet celler. Hos mus dukker der pc’er op mellem embryon dag (E) 10 – E13, mens CN neuroner ved ca. E9 – E1210.
Andre cerebellar neuroner er født meget senere. For eksempel, i mus, den Golgi delpopulation af interneuroner er genereret fra VZ ved (~ E14 − E18) og den resterende interneuroner (kurve celle og stellate celler) placeret i det molekylære lag opstår fra at dividere stamceller i den hvide substans mellem tidligt postnatale (P) 0 – P711. Granule celler genereres fra den eksterne avlsmateriale zone (egz), en sekundær germinale zone, der er afledt af rostral Columns rhombisk LIP og går gennem Terminal division efter fødslen. Men før deres prækursorer opstår fra rhombisk LIP fra E13-E16, har cellerne allerede migreret rostrally langs Pia overfladen for at lave et tyndt lag af celler på rygoverfladen af cerebellum Anlage. Nonneuronal makrogliale celler såsom astrocytter og oligodendrocytter, som stammer fra ventrikulær neuroepitel, er født på e 13.5 − p0 og p0 − P7 henholdsvis11,12,13,14 ,15. Microglia er afledt af blomme-SAC primitive myeloide stamceller mellem E8-E10 og efter invasion i centralnervesystemet kan påvises i muse hjernen af E916.
Metoden i denne artikel er baseret på den, der oprindeligt blev udviklet af Furuya et al. og Tabata et al.17,18, som blev optimeret til primær dyrkning af Purkinje celler afledt af Wistar rotte cerebella. Vi har nu tilpasset denne metode og omhyggeligt modificeret den til at studere væksten af mus cerebellar neuroner19. I modsætning til i vores nye protokol, kold dissektion medium er den vigtigste vaskebuffer anvendes under dissektion og dissociation trin før tilsætning af såning medium i Furuya protokol17. Denne buffer mangler ernæring, vækstfaktorer og hormoner (alle i Dulbecco’s modificerede Eagle medium: næringsstof blanding F-12 [DMEM/F12]), der er nødvendige for at understøtte cellevækst og overlevelse under de førnævnte trin. Ud fra vores omfattende erfaring med murine primære cerebellare kulturer har vi desuden brugt 500 μL kulturmedium i hver brønd (i stedet for 1 mL) og øget Tri-iodothyroninkoncentrationen til 0,5 ng/mL, hvilket forbedrer væksten af neuronal celler, i især dem med en Purkinje celle fænotype, og fremmer den udvækst af dendritiske grene i kulturen. Den vigtigste metode i denne artikel kan anvendes bredt på andre små gnavere (f. eks. egern og hamstere) under fosterudviklingen og kan anvendes til at studere cerebellare neurogenese og differentiering i de forskellige embryonale stadier, som forskellige arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brugen af primære kulturer er en velkendt metode, der gælder for alle typer af neuroner17,18,19. I den præsenterede protokol forklarer vi, hvordan man isolerer cerebellare neuroner og bevarer deres levedygtighed med optimal overlevelse in vitro i højst 3 uger. Primær kultur af cerebellare celler, som blev isoleret ved E15 − E18, bekræfter indsamlingen af tre klasser af store neuroner: pc’er, Golgi celler, og CNs. Celle k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra naturvidenskab og ingeniør Forskningsråd (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040) og Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035) og ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson translational team Grant (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Riferimenti
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
