Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum
Summary
Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.
Abstract
Het gebruik van primaire celculturen is uitgegroeid tot een van de belangrijkste instrumenten om het zenuwstelsel in vitro te bestuderen. Het uiteindelijke doel van het gebruik van dit vereenvoudigde modelsysteem is om een gecontroleerde micro-omgeving te bieden en de hoge overlevingskansen en de natuurlijke kenmerken van gedissocieerde neuronale en niet-neuronale cellen zoveel mogelijk onder in vitro-omstandigheden te handhaven. In dit artikel, we demonstreren een methode van het isoleren van primaire neuronen van de ontwikkelende muis cerebellum, plaatsen van hen in een in vitro omgeving, het vaststellen van hun groei, en het monitoren van hun levensvatbaarheid en differentiatie voor enkele weken. Deze methode is van toepassing op embryonale neuronen die worden losgekoppeld van het cerebellum tussen de embryonale dagen 12 – 18.
Introduction
Voor enkele decennia, cellijnen zijn op grote schaal gebruikt als een high throughput tool in preklinische studies en biologisch onderzoek. Kosteneffectiviteit, snelle groei en vermindering van het gebruik van levende dieren zijn enkele voordelen van het gebruik van deze cellen. Echter, genetische veranderingen en fenotypische veranderingen accumuleren na verschillende passages in vitro1. De identificatie van cellijnen en genetische disgelijkenis van primaire cellen kan leiden tot irreproduceer bare experimenten en valse conclusies2,3,4,5. Daarom, ondanks sommige gelijkenissen met gedifferentieerde cellen zoals neuronen (bijvoorbeeld neurotransmitters, ionenkanalen, receptoren, en andere neuron-specifieke eiwitten), neuronale cellijnen kunnen niet repliceren de volledige fenotype van neuronen. Het gebruik van volwassen neuronen is een andere optie; deze cellen zijn echter niet-delende postmitotische cellen die moeilijk te propageren zijn in cultuur. Bovendien kan opnieuw binnenbrengen in de celcyclus apoptosis6neerslaan.
Driedimensionale (3D) celcultuur, organotypische segment culturen en organoïde culturen zijn ontwikkeld om een omgeving te bieden waarin cellen zich kunnen schikken in een 3D-vorm die de in vivo-instelling nabootst. Zo, cel-naar-cel communicatie, migratie, invasie van tumorcellen in de omringende weefsels, en angiogenese kan worden bestudeerd7. Extra kosten voor het gebruik van extra cellulaire matrix (ECM) eiwitten of synthetische hydrogels als strooisel, moeite met beeldvorming en compatibiliteit met screening-instrumenten met een hoge doorvoer zijn echter aanzienlijke nadelen van 3D celculturing. Een groot nadeel van organotypic weefsel segment cultuur is het gebruik van een grote hoeveelheid dieren en de nadelige effecten van axotomie, wat leidt tot ontoegankelijkheid van de doelstellingen en groeifactoren voor axonen, en bijgevolg neuronale dood8.
Daarom, een alternatieve aanpak, die vermijdt de problemen met cellijnen, de moeilijkheid van het kweken van volwassen cellen, en de complexiteit van de weefsels, is in vitro rijping van onvolgroeide primaire cellen. Primaire cellen worden rechtstreeks afgeleid van menselijk of dierlijk weefsel en gezien met enzymatische en/of mechanische methoden9. De belangrijkste principes van isolatie, seeding en onderhoud in kweekmedium zijn vergelijkbaar, ongeacht de weefsel bron. Echter, de trofische factoren die nodig zijn om proliferatie en rijping te bevorderen zijn zeer cel-specifieke6.
Het kennen van de ‘ geboortedatum ‘ van elk celtype cerebellaire is een vereiste voor het ontwerpen van een primaire cultuur-experiment. In het algemeen, Purkinje cellen (PCs) en de neuronen van de cerebellaire kernen (CN), worden geboren voor de kleinere cellen, met inbegrip van de interneuronen (bv., mand, stervormige cellen) en submodule cellen. Bij muizen ontstaan Pc’s tussen de embryonale dag (E) 10 – E13, terwijl de CN-neuronen ongeveer E9 – E1210.
Andere cerebellaire neuronen worden veel later geboren. Bijvoorbeeld, bij muizen wordt de Golgi-subpopulatie van interneuronen gegenereerd van VZ op (~ E14 − E18) en de overgebleven interneuronen (mand cellen en ecoagriturismo late Cells) in de moleculaire laag ontstaan uit het verdelen van voorlopercellen in de witte stof tussen vroege postnatale (P) 0 – P711. Submodules worden gegenereerd uit de uitwendige Germinal zone (EGZ), een secundaire kiem zone die is afgeleid van de rostrale migratoire Rhombic lip en na de geboorte door Terminal Division gaat. Maar voordat hun precursoren uit de Rhombic lip van E13 – e16 voortvloeien, zijn de cellen al rostraal over het PIA-oppervlak gemigreerd om een dun laagje cellen op het rugoppervlak van het cerebellum Anlage te maken. Niet-neuronale macrogliale cellen zoals astrocyten en oligodendrocyten, die afkomstig zijn van het ventriculaire neuroepitheel, worden geboren bij e 13.5 − P0 en P0 − P7 respectievelijk11,12,13,14 ,15. Microglia zijn afgeleid van dooier-SAC primitieve myeloïde voorlopercellen tussen E8 – E10 en na invasie in het centrale zenuwstelsel kan worden gedetecteerd in de hersenen van de muis door E916.
De methode die in dit artikel wordt weergegeven is gebaseerd op degene die oorspronkelijk werd ontwikkeld door Furuya et al. en Tabata et al.17,18, die was geoptimaliseerd voor primaire kweek van Purkinje cellen afgeleid van Wistar rat cerebella. We hebben deze methode nu aangepast en zorgvuldig aangepast om de groei van muis cerebellaire neuronen19te bestuderen. In tegenstelling tot ons nieuwe protocol, koude dissectie medium is de belangrijkste wasbuffer gebruikt tijdens dissectie en dissociatie stappen voor het toevoegen van zaaien medium in Furuya protocol17. Deze buffer mist de voeding, groeifactoren, en hormonen (alles in Dulbecco’s gemodificeerde adelaar medium: nutriënten mengsel F-12 [DMEM/F12]) die nodig zijn ter ondersteuning van de celgroei en overleving tijdens de bovengenoemde stappen. Bovendien hebben we, op basis van onze uitgebreide ervaring met de primaire cerebellaire culturen van Murine, 500 μL van het kweekmedium in elke put gebruikt (in plaats van 1 mL) en de Tri-iodothyronine-concentratie verhoogd tot 0,5 ng/mL, wat de groei van neuronale cellen verbetert, in met name die met een Purkinje-cel fenotype, en bevordert de uitgroei van dendritische takken in de cultuur. De belangrijkste methode in dit artikel kan in grote lijnen worden toegepast op andere kleine knaagdieren (bijv. eekhoorns en hamsters) tijdens de embryonale ontwikkeling en kan worden gebruikt voor de studie van cerebellaire neurogenese en differentiatie in de verschillende embryonale stadia, die verschillen tussen soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van primaire culturen is een bekende methode die van toepassing is op alle soorten neuronen17,18,19. In het gepresenteerde protocol, leggen we uit hoe cerebellaire neuronen isoleren en hun levensvatbaarheid te behouden met optimale overleving in vitro voor een maximum van 3 weken. Primaire cultuur van cerebellaire cellen, die werden geïsoleerd bij E15 − E18, bevestigt de verzameling van drie klassen van grote neur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studies werden gesteund door subsidies van de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040), en Children’s Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035), en de ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational team subsidie (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Riferimenti
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
