भ्रूणीय माउस सेरिबैलम से अलग न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति
Summary
के रूप में पर्याप्त रूप से संभव के रूप में vivo स्थितियों में प्रतिबिंबित करने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में आयोजन एक आसान काम नहीं है. प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों का उपयोग एक पूरे जीव में कोशिका जीव विज्ञान को समझने की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रदान की प्रोटोकॉल रूपरेखा कैसे सफलतापूर्वक विकसित करने के लिए और संस्कृति भ्रूण माउस सेरेबेलर न्यूरॉन्स.
Abstract
प्राथमिक सेल संस्कृतियों का उपयोग इन विट्रो में तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रमुख उपकरणों में से एक बन गया है। इस सरलीकृत मॉडल प्रणाली का उपयोग करने का अंतिम लक्ष्य एक नियंत्रित microenvironment प्रदान करने और उच्च अस्तित्व की दर और अलग न्यूरॉन और nonneuronal कोशिकाओं की प्राकृतिक सुविधाओं को बनाए रखने के रूप में ज्यादा के रूप में इन विट्रो की स्थिति में संभव के रूप में है. इस लेख में, हम विकासशील माउस सेरिबैलम से प्राथमिक न्यूरॉन्स अलग करने की एक विधि का प्रदर्शन, उन्हें एक इन विट्रो वातावरण में रखने, उनके विकास की स्थापना, और कई हफ्तों के लिए उनकी व्यवहार्यता और भेदभाव की निगरानी. यह विधि भ्रूणीय दिनों 12-18 के बीच सेरिबैलम से अलग भ्रूण न्यूरॉन्स के लिए लागू है।
Introduction
कई दशकों के लिए, सेल लाइनों व्यापक रूप से पूर्व नैदानिक अध्ययन और जैविक अनुसंधान में एक उच्च थ्रूपुट उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. लागत प्रभावशीलता, तेजी से विकास, और जीना पशु उपयोग की कमी इन कोशिकाओं का उपयोग करने के कुछ लाभ हैं. तथापि, आनुवंशिक परिवर्तन और फीनोटाइपिक परिवर्तन इन विट्रो1में कई मार्ग के बाद जमा होते हैं। कोशिका रेखाओं की गलत पहचान और प्राथमिक कोशिकाओं से आनुवंशिक विषमता के कारण अशोध्य प्रयोग और गलत निष्कर्ष2,3,4,5हो सकते हैं . इसलिए, इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में विभेदित कोशिकाओं के लिए कुछ समानताएं के बावजूद (जैसे, न्यूरोट्रांसमीटर, आयन चैनल, रिसेप्टर्स, और अन्य न्यूरॉन विशेष प्रोटीन), न्यूरॉन सेल लाइनों न्यूरॉन्स के पूर्ण phenotype नकल नहीं कर सकते. परिपक्व न्यूरॉन्स का उपयोग करना एक और विकल्प है; हालांकि, इन कोशिकाओं को गैर विभाजित postmitotic कोशिकाओं है कि संस्कृति में प्रचार करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. इसके अलावा, सेल चक्र में फिर से प्रवेश apoptosis6वेग हो सकता है.
तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों, और organoid संस्कृतियों एक वातावरण है जिसमें कोशिकाओं को एक 3 डी रूप है कि vivo सेटिंग में mimics में व्यवस्था कर सकते हैं प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है. इस प्रकार, सेल से सेल संचार, प्रवास, आसपास के ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण, और एंजियोजेनेसिस का अध्ययन किया जा सकताहै 7. हालांकि, एक बिस्तर के रूप में अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन या सिंथेटिक hydrogels का उपयोग करने की अतिरिक्त लागत, इमेजिंग में कठिनाई, और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग उपकरणों के साथ संगतता 3 डी सेल culturing के काफी कमियां हैं. organotypic ऊतक टुकड़ा संस्कृति का एक प्रमुख नुकसान जानवरों की एक बड़ी संख्या का उपयोग और एक्सोटोमी के प्रतिकूल प्रभाव है, जो axons के लिए लक्ष्य और विकास कारकों की अगम्यता की ओर जाता है, और फलस्वरूप न्यूरॉन मौत8.
इसलिए, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, जो सेल लाइनों के साथ समस्याओं से बचा जाता है, परिपक्व कोशिकाओं को बढ़ने की कठिनाई, और ऊतकों की जटिलता, अपरिपक्व प्राथमिक कोशिकाओं के इन विट्रो परिपक्वता में है। प्राथमिक कोशिकाएं सीधे मानव या पशु ऊतक से प्राप्त होती हैं और एंजाइमी और/या यांत्रिक विधियों का उपयोग करके अलग होजाती हैं 9. अलगाव के मुख्य सिद्धांत, बोने, और संस्कृति के माध्यम में रखरखाव ऊतक स्रोत की परवाह किए बिना समान हैं. तथापि, प्रसार और परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक ट्राफिक कारक अत्यधिक सेल विशिष्ट6हैं।
प्रत्येक सेरेबेलर सेल प्रकार की ‘जन्मतिथि’ को जानना प्राथमिक संस्कृति प्रयोग को डिजाइन करने के लिए एक शर्त है। सामान्य में, Purkinze कोशिकाओं (पीसी) और सेरेबेलर नाभिक (सीएन) के न्यूरॉन्स, छोटे कोशिकाओं से पहले पैदा होते हैं, interneurons सहित (उदाहरण के लिए, टोकरी, स्टेलेट कोशिकाओं) और ग्रेन्युल कोशिकाओं. चूहों में, पीसी भ्रूण दिन के बीच उभरने (E)10-E13, जबकि सीएन न्यूरॉन्स लगभग E9-E1210पर.
अन्य सेरेबेलर न्यूरॉन्स बहुत बाद में पैदा होते हैं. उदाहरण के लिए, चूहों में, interneurons के Golgi subpopulation पर V से उत्पन्न कर रहे हैं ([E14]E18) और शेष interneurons (बास्केट सेल और स्टेलेट कोशिकाओं) आणविक परत में स्थित के बीच सफेद मामले में संतति कोशिकाओं को विभाजित करने से उभरने जल्दी प्रसवोत्तर (पी)0-P711| ग्रैन्यूल कोशिकाएं बाह्य जनन क्षेत्र (ईजीजेड) से उत्पन्न होती हैं, एक द्वितीयक जनन क्षेत्र जो रोस्ट्रिक समचतुर्भुज होंठ से व्युत्पन्न होता है और जन्म के बाद टर्मिनल विभाजन के माध्यम से जाता है। लेकिन इससे पहले कि उनके अग्रदूतों E13-E16 से विषम होंठ से उत्पन्न, कोशिकाओं को पहले से ही pia सतह के साथ rostrally स्थानांतरित कर दिया है सेरिबैलम anlage के पृष्ठीय सतह पर कोशिकाओं की एक पतली परत बनाने के लिए. गैर-न्यूरोनल मैक्रोग्लियल कोशिकाएं जैसे एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेनड्रोसाइट्स, जो वेंट्रिकुलर न्यूरोएपिथेलियम से उत्पन्न होते हैं, क्रमशः E13.5 डिग्री पी0 और पी0जेड पी7 में पैदा होते हैं11,12,13,14 ,15. माइक्रोग्लिया ई8-E10 के बीच और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में आक्रमण के बाद ई916द्वारा माउस मस्तिष्क में पाया जा सकता है के बीच जर्दी-सैक आदिम माइलॉयड जनक कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं।
इस लेख में प्रस्तुत विधि एक मूल रूप से Furuya एट अल द्वारा विकसित पर आधारित है और Tabata एट अल17,18, जो विस्टार चूहे सेरेबेला से व्युत्पन्न Purkinze कोशिकाओं के प्राथमिक culturing के लिए अनुकूलित किया गया था. अब हमने इस विधि को अनुकूलित किया है और माउस सेरेबेलर न्यूरॉन्स19के विकास का अध्ययन करने के लिए इसे सावधानीपूर्वक संशोधित किया है . हमारे नए प्रोटोकॉल के विपरीत, ठंड विच्छेदन माध्यम मुख्य धोने बफर Furuya के प्रोटोकॉल17में बोने के माध्यम जोड़ने से पहले विच्छेदन और विच्छेदन कदम के दौरान प्रयोग किया जाता है। इस बफर पोषण का अभाव है, विकास कारक, और हार्मोन (सभी Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम में: पोषक मिश्रण F-12 [DMEM/F12]) कि ऊपर उल्लिखित चरणों के दौरान सेल विकास और अस्तित्व का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं. इसके अलावा, murine प्राथमिक सेरेबेलर संस्कृतियों के साथ हमारे व्यापक अनुभव के आधार पर, हम प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 500 डिग्री सेल्सियस का इस्तेमाल किया है (के बजाय 1 एमएल) और करने के लिए त्रि-iodothyronine एकाग्रता में वृद्धि 0.5 एनजी / विशेष रूप से उन लोगों के साथ एक Purkinze सेल phenotype, और संस्कृति में डेन्ड्रिटिक शाखाओं के विकास को बढ़ावा देता है. इस लेख में विशेष रुप से प्रदर्शित प्रमुख विधि मोटे तौर पर भ्रूण के विकास के दौरान अन्य छोटे कृन्तकों (उदाहरण के लिए, गिलहरी और hamsters) के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न भ्रूण चरणों में सेरेबेलर neurogenesis और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो प्रजातियों के बीच अलग.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग सभी प्रकार के न्यूरॉन्स17,18,19के लिए लागू एक प्रसिद्ध विधि है . प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम समझा कैसे सेरेबेलर न्यूरॉन्स को अलग करने और की ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इन अध्ययनों से प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एचएम: NSERC डिस्कवरी अनुदान ] RGPIN-2018-06040) से अनुदान द्वारा समर्थित थे, और बाल अस्पताल अनुसंधान संस्थान Manitoba (HM: अनुदान $ 320035), और ALS कनाडा-ब्रेन कनाडा आर्थर जे. हडसन अनुवाद टीम अनुदान (जेके, एचएम).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Riferimenti
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