Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale
Summary
Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L’uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.
Abstract
L’uso delle colture cellulari primarie è diventato uno dei principali strumenti per studiare il sistema nervoso in vitro. L’obiettivo finale dell’utilizzo di questo sistema di modelli semplificato è quello di fornire un microambiente controllato e mantenere l’alto tasso di sopravvivenza e le caratteristiche naturali delle cellule neuronali e non neuronali dissociate il più possibile in condizioni in vitro. In questo articolo, dimostriamo un metodo per isolare i neuroni primari dal cervelletto del topo in via di sviluppo, collocandoli in un ambiente in vitro, stabilendo la loro crescita e monitorandone la fattibilità e la differenziazione per diverse settimane. Questo metodo è applicabile ai neuroni embrionali dissociati dal cervelletto tra i giorni embrionali 12-18.
Introduction
Per diversi decenni, le linee cellulari sono state ampiamente utilizzate come strumento ad alto throughput negli studi preclinici e nella ricerca biologica. Convenienza, rapida crescita, e la riduzione dell’uso di animali vivi sono alcuni vantaggi dell’utilizzo di queste cellule. Tuttavia, alterazioni genetiche e cambiamenti fenotipici si accumulano dopo diversi passaggi in vitro1. L’errata identificazione delle linee cellulari e la dissimilità genetica dalle cellule primarie può portare a esperimenti irriproducibili e false conclusioni2,3,4,5. Pertanto, nonostante alcune somiglianze con cellule differenziate come i neuroni (ad esempio, neurotrasmettitori, canali ionici, recettori e altre proteine specifiche del neurone), le linee cellulari neuronali non possono replicare il fenotipo completo dei neuroni. Utilizzando neuroni maturi è un’altra opzione; tuttavia, queste cellule sono cellule postmitotiche non dividendo che sono difficili da propagare in coltura. Inoltre, il rientro nel ciclo cellulare può precipitare l’apoptosi6.
Sono state sviluppate colture cellulari tridimensionali (3D), colture di fette organotipiche e colture organoidi per fornire un ambiente in cui le cellule possono disporre in una forma 3D che imita l’ambiente in vivo. Così, la comunicazione cellula-cellula, la migrazione, l’invasione delle cellule tumorali nei tessuti circostanti e l’angiogenesi possono essere studiate7. Tuttavia, i costi aggiuntivi dell’utilizzo di proteine a matrice cellulare extra (ECM) o idrogel sintetici come biancheria da letto, difficoltà nell’imaging e compatibilità con strumenti di screening ad alta produttività sono notevoli inconvenienti della coltura cellulare 3D. Uno dei principali svantaggi della coltura della falce del tessuto organotipipico è l’uso di un gran numero di animali e gli effetti negativi dell’asotomia, che porta all’inaccessibilità degli obiettivi e ai fattori di crescita per gli assoni, e di conseguenza alla morte neuronale8.
Pertanto, un approccio alternativo, che evita i problemi con le linee cellulari, la difficoltà di far crescere le cellule mature e la complessità dei tessuti, è nella maturazione in vitro delle cellule primarie immature. Le cellule primarie sono derivate direttamente dal tessuto umano o animale e dissociate utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici9. I principi principali di isolamento, seming, e la manutenzione in mezzo di coltura sono simili indipendentemente dalla fonte di tessuto. Tuttavia, i fattori trofici necessari per promuovere la proliferazione e la maturazione sono altamente specifici per le cellule6.
Conoscere la “data di nascita” di ogni tipo di cellula cerebellare è un prerequisito per la progettazione di un esperimento di coltura primaria. In generale, le cellule Purkinje (PC) e i neuroni dei nuclei cerebellari (CN), nascono prima delle cellule più piccole, compresi gli interneuroni (ad esempio, cesti, cellule stellate) e le cellule granule. Nei topi emergono PC tra il giorno embrionale (E)10–E13, mentre i neuroni CN a circa E9–E1210.
Altri neuroni cerebellari nascono molto più tardi. Ad esempio, nei topi, la sottopopolazione Golgi degli interneuroni è generata dal V, a (E14-E18) e gli interneuroni rimanenti (cellule del cestino e cellule stellate) situate nello strato molecolare emergono dalla divisione delle cellule progenitrici nella materia bianca tra le prime postnatale (P)0–P711. Le cellule di granulo sono generate dalla zona germinale esterna (EGz), una zona germinale secondaria che deriva dal labbro rombico rostrale e passa attraverso la divisione terminale dopo la nascita. Ma prima che i loro precursori sorgono dal labbro rombico dell’E13-E16, le cellule sono già migrati sontuosamente lungo la superficie del pia per creare un sottile strato di cellule sulla superficie dorsale dell’anlage del cervelletto. Le cellule macrogliali non neuronali come gli astrociti e gli oligodendrociti, che provengono dal neuroepitelio ventricolare, nascono rispettivamente a E13.5 e P0-P7rispettivamente 11,12,13,14 ,15. Le microglia sono derivate da cellule progenitrici mieloidi primitive di tuorlo-sac tra E8-E10 e dopo l’invasione nel sistema nervoso centrale possono essere rilevate nel cervello del topo da E916.
Il metodo presentato in questo articolo si basa su quello originariamente sviluppato da Furuya et al. e Tabata et al.17,18, che è stato ottimizzato per la coltura primaria delle cellule Purkinje derivate da Wistar rat cerebella. Ora abbiamo adattato questo metodo e attentamente modificato per studiare la crescita dei neuroni cerebellari del topo19. A differenza del nostro nuovo protocollo, il mezzo di dissezione a freddo è il buffer di lavaggio principale utilizzato durante le fasi di dissezione e dissociazione prima di aggiungere il mezzo di semina nel protocollo furuya17. Questo buffer manca la nutrizione, fattori di crescita, e ormoni (tutti nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco:miscela nutriente F-12 [DMEM/F12]) che sono necessari per sostenere la crescita cellulare e la sopravvivenza durante i passaggi di cui sopra. Inoltre, sulla base della nostra vasta esperienza con le colture cerebellari primarie murine, abbiamo usato 500 l di mezzo di coltura in ogni pozzo (invece di 1 mL) e aumentato la concentrazione di tri-iodothyronine a 0,5 ng/mL, che migliora la crescita delle cellule neuronali, in particolari di quelli con un fenotipo della cellula Purkinje, e promuove la crescita dei rami dendritici nella cultura. Il metodo principale descritto in questo articolo può essere ampiamente applicato ad altri piccoli roditori (ad esempio, scoiattoli e criceti) durante lo sviluppo embrionale e può essere utilizzato per studiare la neurogenesi cerebellare e la differenziazione nei vari stadi embrionali, che differiscono tra le specie.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso delle culture primarie è un metodo ben noto applicabile a tutti i tipi di neuroni17,18,19. Nel protocollo presentato, spieghiamo come isolare i neuroni cerebellari e mantenere la loro vitalità con la sopravvivenza ottimale in vitro per un massimo di 3 settimane. La coltura primaria delle cellule cerebellari, che sono state isolate all’E15-E18, conferma la raccolta di tre classi di grandi neuroni: PC, cellule Golgi e CN. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questi studi sono stati sostenuti da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (HM: NSERC Discovery Grant – RGPIN-2018-06040), e del Children Hospital Research Institute di Manitoba (HM: Grant n. 320035), e della ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Riferimenti
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
