Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

Summary

Realizar experimentos in vitro para refletir as condições in vivo da forma mais adequada possível não é uma tarefa fácil. O uso de culturas celulares primárias é um passo importante para a compreensão da biologia celular em um organismo inteiro. O protocolo fornecido descreve como crescer com sucesso e cultura embrionária mouse neurônios cerebelares.

Abstract

O uso de culturas de células primárias tornou-se uma das principais ferramentas para estudar o sistema nervoso in vitro. O objetivo final de usar este sistema de modelo simplificado é fornecer um microambiente controlado e manter a alta taxa de sobrevivência e as características naturais de células neuronais e não neuronais dissociadas, tanto quanto possível condições in vitro. Neste artigo, demonstramos um método de isolar os neurônios primários do cérebro de camundongo em desenvolvimento, colocando-os em um ambiente in vitro, estabelecendo seu crescimento e monitorando sua viabilidade e diferenciação por várias semanas. Este método é aplicável aos neurônios embrionários dissociados do cerebelo entre os dias embrionários 12-18.

Introduction

Por diversas décadas, as linhas de pilha foram amplamente utilizadas como uma ferramenta elevada da passagem em estudos preclinical e na pesquisa biológica. Custo-efetividade, crescimento rápido e redução do uso de animais vivos são alguns benefícios do uso dessas células. No entanto, alterações genéticas e alterações fenotípicas se acumulam após várias passagens in vitro¹. A identificação incorreta das linhas celulares e a dessemelhança genética das células primárias pode levar a experimentos irreprodutíveis e conclusões falsas^2,3,4,5. Portanto, apesar de algumas semelhanças com células diferenciadas, como neurônios (por exemplo, neurotransmissores, canais de íons, receptores e outras proteínas neuronais específicas), as linhas celulares neuronais não podem replicar o fenótipo completo dos neurônios. Usar neurônios maduros é outra opção; no entanto, essas células são células pós-mitocóticas não divisórias que são difíceis de propagar na cultura. Além disso, a reentrada no ciclo celular pode precipitar a apoptose⁶.

Cultura celular tridimensional (3D), culturas organotípicas de fatias e culturas organóides foram desenvolvidas para fornecer um ambiente no qual as células podem organizar em uma forma 3D que imita o cenário in vivo. Assim, a comunicação célula-célula, migração, invasão de células tumorais em tecidos circundantes, e angiogênese pode ser estudado⁷. No entanto, os custos adicionais do uso de proteínas de matriz celular extra (ECM) ou hidrogéis sintéticos como cama, dificuldade em imagem e compatibilidade com instrumentos de triagem de alta taxa de produção são desvantagens consideráveis de cultivo de células 3D. Uma grande desvantagem da cultura organotípica fatia de tecido é o uso de um grande número de animais e os efeitos adversos da axotomia, o que leva à inacessibilidade de alvos e fatores de crescimento para axônios, e, conseqüentemente, a morte neuronal⁸.

Portanto, uma abordagem alternativa, que evita os problemas com as linhas celulares, a dificuldade de crescimento de células maduras e complexidade dos tecidos, é a maturação in vitro das células primárias imaturas. As células primárias são derivadas diretamente do tecido humano ou animal e dissociadas usando métodos enzimáticos e/ou mecânicos^9. Os principais princípios de isolamento, semeade e manutenção em meio de cultura são semelhantes, independentemente da fonte do tecido. No entanto, os fatores tróficos necessários para promover a proliferação e maturação são altamente específicos^{de células 6.}

Conhecer a “data de nascimento” de cada tipo de célula cerebellar é um pré-requisito para projetar um experimento de cultura primária. Em geral, as células de Purkinje (PCs) e os neurônios dos núcleos cerebelares (CN), nascem diante das células menores, incluindo interneurônios (por exemplo, cesta, células stellate) e células de grânulos. Em camundongos, os PCs emergem entre o dia embrionário (E)10-E13, enquanto os neurônios CN em aproximadamente E9-E12¹⁰.

Outros neurônios cerebelares nascem muito mais tarde. Por exemplo, em camundongos, a subpopulação golgi de interneurônios são gerados a partir de VZ em (~E14-E18) e os interneurônios restantes (células cestos e células stellate) localizados na camada molecular emergem da divisão de células progenitoras na matéria branca entre os primeiros pós-natal (P)0-P7¹¹. As células granule são geradas a partir da zona germinal externa (EGZ), uma zona germinal secundária que é derivada do lábio romébico rostral e passa por divisão terminal após o nascimento. Mas antes de seus precursores surgirem a partir do lábio rébico de E13-E16, as células já migraram rosatralido ao longo da superfície da pia para fazer uma fina camada de células na superfície dorsal do âmino anlage. Células macrogliais não neuronais, como astrócitos e oligodendrócitos, que se originam do neuroepitélio ventricular, nascem em E13,5−P0 e P0−P7 respectivamente^{11,12,13,14 15.} Microglia são derivados de células progenitoras mieloides primitivas de gema-sac entre E8-E10 e após a invasão no sistema nervoso central pode ser detectado no cérebro do rato por E9¹⁶.

O método apresentado neste artigo é baseado no originalmente desenvolvido por Furuya et al. e Tabata et al.^17,18, que foi otimizado para o cultivo primário de células Purkinje derivadas de cerebelo de rato Wistar. Nós já adaptou este método e cuidadosamente modificado para estudar o crescimento dos neurônios cerebelares do rato¹⁹. Ao contrário do nosso novo protocolo, o meio de dissecação a frio é o principal amortecedor de lavagem usado durante as etapas de dissecção e dissociação antes de adicionar o meio de semeada no protocolo¹⁷de Furuya. Este amortecedor não tem a nutrição, fatores de crescimento e hormônios (tudo no meio modificado de Águia de Dulbecco: mistura de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que são necessárias para apoiar o crescimento celular e a sobrevivência durante os passos acima mencionados. Além disso, com base em nossa extensa experiência com culturas cerebelares primárias murina, usamos 500 μL de meio de cultura em cada poço (em vez de 1 mL) e aumentamos a concentração de tri-iodothyronine para 0,5 ng/mL, o que melhora o crescimento das células neuronais, em particularaqueles com um fenótipo de célula sardrugiano Purkinje, e promove a conseqüência de ramos dendríticos na cultura. O principal método apresentado neste artigo pode ser amplamente aplicado a outros pequenos roedores (por exemplo, esquilos e hamsters) durante o desenvolvimento embrionário e pode ser usado para estudar neurogênese cerebelar e diferenciação nas várias fases embrionárias, que diferem entre as espécies.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com os regulamentos institucionais e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais do Conselho Canadense de Cuidados Com Animais e foi aprovado pelas autoridades locais (“o Bannatyne Campus Animal Care Comitê”). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número e o sofrimento dos animais utilizados. A profundidade adequada da anestesia foi confirmada observando que não houve alteração na frequência respiratória associada à manipulação e pita…

Representative Results

Com base nas diferentes datas de nascimento dos subtipos neuronais no cerebelo, as culturas dos embriões de camundongos E12-E18 produziram diferentes tipos de células. Neurônios de projeção grande, como neurônios CN (E9-E12) e PCs (E10-E13), surgiram cedo durante o desenvolvimento cerebelar. Em camundongos, células de grânulo e Golgi surgiram entre ~E13-E18 e foram submetidas a divisões terminais até a semana pós-natal 4. Substituindo o velho meio I por uma cultura fresca média II …

Discussion

O uso de culturas primárias é um método bem conhecido aplicável para todos os tipos de neurônios^17,18,19. No protocolo apresentado, explicamos como isolar os neurônios cerebelares e manter sua viabilidade com a sobrevivência ideal in vitro por um máximo de 3 semanas. A cultura primária das células cerebelares, que foram isoladas na E15-E18, confirma a coleta de três classes de grandes neurônios: PCs, células Golgi e…

Materials

Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager