Primär kultur av neuroner isolerade från embryonala mus cerebellum
Summary
Att utföra in vitro-experiment för att återspegla in vivo-förhållanden så väl som möjligt är inte en lätt uppgift. Användningen av primära cellkulturer är ett viktigt steg mot att förstå cellbiologi i en hel organism. Den medföljande protokollet beskriver hur man framgångsrikt växa och kultur embryonala mus cerebellär nervceller.
Abstract
Användningen av primära cellkulturer har blivit ett av de viktigaste verktygen för att studera nervsystemet in vitro. Det slutgiltiga målet med att använda detta förenklade modellsystem är att ge en kontrollerad mikromiljö och bibehålla den höga överlevnaden och de naturliga dragen hos dissocierade neuronala och nonneuronala celler så mycket som möjligt under in vitro-betingelser. I denna artikel, vi visar en metod för att isolera primära nervceller från att utveckla mus cerebellum, placera dem i en in vitro-miljö, etablera sin tillväxt, och övervaka deras lönsamhet och differentiering i flera veckor. Denna metod är tillämplig på embryonala neuroner separerade från lillhjärnan mellan embryonala dagar 12 – 18.
Introduction
I flera decennier har cellinjer använts flitigt som ett högt genomflöde verktyg i prekliniska studier och biologisk forskning. Kostnadseffektivitet, snabb tillväxt och minskad användning av levande djur är några fördelar med att använda dessa celler. Emellertid, genetiska förändringar och fenotypiska förändringar ackumuleras efter flera passager in vitro-1. Felidentifiering av cellinjer och genetisk dissimilaritet från primära celler kan leda till irreproducerbara experiment och falska slutsatser2,3,4,5. Därför, trots vissa likheter med differentierade celler såsom nervceller (t. ex., signalsubstanser, jonkanaler, receptorer, och andra neuron-specifika proteiner), neuronala cellinjer kan inte replikera hela fenotyp av nervceller. Använda mogna nervceller är ett annat alternativ; dessa celler är dock icke-skiljande postmitotiska celler som är svåra att sprida i kulturen. Dessutom kan återinträde i cellcykeln utlösa apoptos6.
Tredimensionell (3D) cellkultur, organotypic slice kulturer, och Organoid kulturer har utvecklats för att ge en miljö där celler kan ordna i en 3D-form som härmar in vivo inställning. Således, cell-till-cellkommunikation, migration, invasion av tumörceller i omgivande vävnader, och angiogenes kan studeras7. Men ytterligare kostnader för att använda extra cellulära Matrix (ECM) proteiner eller syntetiska hydrogeler som ett strö, svårigheter att avbilda, och kompatibilitet med hög kapacitet screening instrument är betydande nackdelar med 3D-cellodling. En stor nackdel med organotypic vävnad slice kultur är användningen av ett stort antal djur och de negativa effekterna av axotomi, vilket leder till otillgänglighet av mål och tillväxtfaktorer för axoner, och därmed neuronala död8.
Därför är en alternativ metod, som undviker problem med cellinjer, svårigheten att växa mogna celler, och komplexiteten i vävnader, in vitro-mognad av omogna primära celler. Primär cellerna härstammar direkt från vävnad från människa eller djur och separeras med hjälp av enzymatiska och/eller mekaniska metoder9. De viktigaste principerna för isolering, sådd och underhåll i odlingssubstrat är likartade oavsett vävnads källa. Emellertid, de trofiska faktorer som krävs för att främja spridning och mognad är mycket cellspecifika6.
Att känna till “födelsedatum” för varje cerebellär celltyp är en förutsättning för att utforma en primär kultur experiment. I allmänhet, Purkinje celler (PCs) och nervceller i lillhjärnan kärnor (CN), är födda före de mindre cellerna, inklusive interneuroner (t. ex., korg, stellate celler) och granule celler. Hos möss uppstår datorer mellan embryonala dagen (E) 10 – E13, medan KN-neuroner vid cirka E9 – E1210.
Andra cerebellär nervceller föds mycket senare. Till exempel, hos möss, den Golgi subpopulation av interneuroner genereras från VZ på (~ E14 − E18) och de återstående interneuroner (korg cell och stellate celler) som ligger i det molekylära skiktet dyka upp från att dividera stamceller i den vita substansen mellan tidig postnatal (P) 0 – P711. Granule celler genereras från den yttre avelsmaterial Zone (egz), en sekundär avelsmaterial zon som härrör från rostralt rhombic läpp och går igenom terminalen Division efter födseln. Men innan deras prekursorer uppstår från rhombic läpp från E13-E16, cellerna har redan migrerat rostrally längs Pia ytan för att göra ett tunt lager av celler på rygg ytan av lillhjärnan Anlage. Nonneuronala makrogliala celler som astrocyter och oligodendrocyter, som härstammar från det ventrikulära neuroepitelet, är födda vid e 13,5 − P0 och P0 − P7 respektive11,12,13,14 ,15. Microglia härstammar från gula-SAC primitiva myeloida stamceller mellan E8-E10 och efter invasionen i centralanervsystemet kan upptäckas i mushjärna av E916.
Den metod som presenteras i denna artikel är baserad på den som ursprungligen utvecklades av Furuya et al. och Tabata et al.17,18, som var optimerad för primär odling av Purkinje celler som härrör från Wistar råtta cerebella. Vi har nu anpassat denna metod och noggrant modifierade den för att studera tillväxten av mus cerebellär neuroner19. Till skillnad från i vårt nya protokoll, är kallt dissektion medium den huvudsakliga tvättbuffert som används under dissektion och dissociation steg innan du lägger sådd medium i Furuya protokoll17. Denna buffert saknar näring, tillväxtfaktorer, och hormoner (alla i Dulbecco modifierade Eagle medium: näringsämne blandning F-12 [DMEM/F12]) som är nödvändiga för att stödja celltillväxt och överlevnad under de ovan nämnda stegen. Dessutom, baserat på vår långa erfarenhet med murina primära cerebellär kulturer, vi har använt 500 μl av odlingssubstrat i varje brunn (i stället för 1 ml) och ökade tri-iodothyronine koncentrationen till 0,5 ng/ml, vilket förbättrar tillväxten av neuronala celler, i särskilt de med en Purkinje cell fenotyp, och främjar utväxt av dendritiska grenar i kulturen. Den huvudsakliga metoden i denna artikel kan i stor utsträckning tillämpas på andra små gnagare (t. ex. ekorrar och hamstrar) under embryonal utveckling och kan användas för att studera cerebellär neurogenes och differentiering i de olika embryonala stadierna, som olika arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av primär kulturer är en välkänd metod som gäller för alla typer av nervceller17,18,19. I det presenterade protokollet, förklarar vi hur man isolerar cerebellär neuroner och bibehålla sin livskraft med optimal överlevnad in vitro i högst 3 veckor. Primärkulturen i cerebellär celler, som isolerades på E15 − E18, bekräftar insamlingen av tre klasser av stora nervceller: PCs, Golgi celler, och CNs. Ce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dessa studier stöddes av bidrag från naturvetenskap och teknik forskningrådet (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040), och Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035), och ALS Canada-hjärna Kanada Arthur J. Hudson Translational team Grant (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Riferimenti
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
