Primær kultur neurons isolert fra embryonale mus lillehjernen

Summary

Det er ikke en lett oppgave å utføre in vitro-eksperimenter for å reflektere in vivo-forhold så godt som mulig. Bruken av primær cellekulturer er et viktig skritt mot å forstå cellebiologi i en hel organisme. Den oppgitte protokollen skisserer hvordan du lykkes vokse og kultur embryonale musen lillehjernen neurons.

Abstract

Bruken av primær cellekulturer har blitt en av de viktigste verktøyene for å studere nervesystemet in vitro. Det endelige målet med å bruke dette forenklede modell systemet er å gi en kontrollert mikromiljøet og opprettholde den høye overlevelsesraten og de naturlige egenskapene til dissosiert neuronal og nonneuronal celler så mye som mulig under in vitro forhold. I denne artikkelen viser vi en metode for å isolere primære neurons fra å utvikle musen lillehjernen, plassere dem i et in vitro miljø, etablere sin vekst, og overvåke deres levedyktighet og differensiering i flere uker. Denne metoden gjelder for embryonale neurons dissosiert fra lillehjernen mellom embryonale dager 12-18.

Introduction

I flere ti år har cellelinjer blitt mye brukt som en høy gjennomstrømming verktøy i prekliniske studier og biologisk forskning. Kostnadseffektivitet, rask vekst, og reduksjon av levende dyr bruk er noen fordeler ved å bruke disse cellene. Men genetiske endringer og phenotypical endringer akkumuleres etter flere passasjer in vitro¹. Forveksling av cellelinjer og genetiske dissimilarity fra primær celler kan føre til ved uforklarlige eksperimenter og falske konklusjoner^2,3,4,5. Derfor, til tross for noen likheter med differensiert celler som neurons (f. eks, nevrotransmittere, ion kanaler, reseptorer, og andre Nevron-spesifikke proteiner), neuronal cellelinjer kan ikke gjenskape den fulle fenotype av neurons. Bruke modne neurons er et annet alternativ; disse cellene er imidlertid ikke-dividere postmitotic celler som er vanskelig å spre i kulturen. Videre re-oppføring i celle syklus kan utløse apoptose⁶.

Tredimensjonal (3D) cellekultur, organotypic skive kulturer, og organoid kulturer har blitt utviklet for å gi et miljø der cellene kan ordne i en 3D-form som etterligner in vivo innstillingen. Således, celle-til-celle kommunikasjon, migrasjon, invasjon av tumorceller i omkringliggende vev, og angiogenese kan bli studert⁷. Men, ekstra kostnader ved bruk av ekstra mobilnettet matrise (ECM) proteiner eller syntetiske hydrogeler som et sengetøy, vanskeligheter med bildebehandling, og kompatibilitet med høy gjennomstrømming screening instrumenter er betydelige ulemper av 3D celle dyrking. En stor ulempe med organotypic vev Slice kultur er bruken av et stort antall dyr og de negative virkningene av axotomy, som fører til utilgjengelighet av mål og vekstfaktorer for axons, og følgelig neuronal død⁸.

Derfor er en alternativ tilnærming, som unngår problemer med cellelinjer, vanskeligheten av voksende modne celler, og kompleksiteten av vev, er in vitro modning av umodne primære celler. Primær-celler er avledet direkte fra menneske eller animalsk vev og dissosiert ved hjelp av enzymatisk og/eller mekaniske metoder⁹. De viktigste prinsippene for isolasjon, seeding, og vedlikehold i kultur medium er like uavhengig av vevs kilden. Imidlertid er de trofiske faktorene som er nødvendige for å fremme spredning og modning svært celle spesifikk⁶.

Å vite det ‘ fødselsdato av hver lillehjernen celle type er en forutsetning for å designe en primær kultur eksperiment. Generelt, Purkinje celler (PCs) og neurons av lillehjernen kjerner (CN), er født før de mindre cellene, inkludert interneurons (f. eks, kurv, Stel celler) og granule celler. I mus, PCer komme mellom embryonale dagen (E) 10-E13, mens CN neurons på ca E9-E12¹⁰.

Andre lillehjernen neurons er født mye senere. For eksempel, i mus, Golgi pasientpopulasjonen av interneurons er generert fra VZ på (~ E14 − E18) og de resterende interneurons (kurv celle og Stel celler) som ligger i molekyl laget komme fra å dele stamceller i den hvite saken mellom tidlig Postnatal (P) 0 – P7¹¹. Granule celler er generert fra den eksterne Germinal sonen (EGZ), en sekundær Germinal sone som er avledet fra rostral rhombic leppe og går gjennom Terminal divisjon etter fødselen. Men før deres forløpere oppstår fra rhombic leppe fra E13-E16, har cellene allerede migrert rostrally langs Pia overflate for å gjøre et tynt lag av celler på rygg overflaten av lillehjernen anlage. Nonneuronal macroglial celler som astrocytter og oligodendrocytes, som stammer fra ventrikkel neuroepithelium, er født på e 13,5 − p0 og p0 − P7 henholdsvis^{11,12,13,14 ,15}. Mikroglia er avledet fra eggeplomme-SAC primitive myelogen stamceller mellom E8-E10 og etter invasjonen i sentralnervesystemet kan oppdages i musen hjernen ved E9¹⁶.

Metoden som presenteres i denne artikkelen er basert på den som opprinnelig ble utviklet av FURUYA et al. og Tabata et al.^17,18, som var optimalisert for primær dyrking av Purkinje celler avledet fra Wistar Rat cerebella. Vi har nå tilpasset denne metoden og nøye modifisert den til å studere veksten av mus lillehjernen neurons¹⁹. I motsetning til inne våre ny protokollen, kulden disseksjon medium er det hovedavdeling vasket buffer anvendt i løpet av disseksjon og dissosiasjon skritt tidligere tilføyer seeding medium inne FURUYA ‘ protokollen¹⁷. Denne bufferen mangler ernæring, vekstfaktorer, og hormoner (alt i Dulbecco ‘ s modifisert Eagle medium: næringsstoff blanding F-12 [DMEM/F12]) som er nødvendig for å støtte cellevekst og overlevelse i løpet av de nevnte trinnene. I tillegg, basert på vår omfattende erfaring med murine primære lillehjernen kulturer, har vi brukt 500 μL av kultur medium i hver brønn (i stedet for 1 mL) og økt Tri-iodothyronine konsentrasjon til 0,5 ng/mL, noe som forbedrer veksten av neuronal celler, i spesielt de med en Purkinje celle fenotype, og fremmer utvekst av dendrittiske grener i kulturen. Den viktigste metoden omtalt i denne artikkelen kan grovt brukes på andre små gnagere (f. eks, ekorn og hamstere) under embryonale utviklingen og kan brukes til å studere lillehjernen neurogenesis og differensiering i de ulike embryonale stadier, som variere mellom arter.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med institusjonelle forskrifter og guide til omsorg og bruk av eksperimentelle dyr fra Canadian Council for Animal Care og har blitt godkjent av lokale myndigheter (“The Bannatyne campus Animal Care Komiteen “). Alle anstrengelser var innrettet til minimere antallet og lider av dyrene anvendt. Tilstrekkelig dybde av anestesi ble bekreftet ved å observere at det ikke var noen endring i respirasjonsfrekvensen forbundet med manipulasjon og tå knipe eller hornhinnen refleks. <p…

Representative Results

Basert på de forskjellige bursdager av neuronal under typer i lillehjernen, ga kulturer fra E12-E18 en mus embryo forskjellige celletyper. Store projeksjons neurons, slik som CN neurons (E9 − E12) og PCs (E10 − E13), oppsto tidlig under lillehjernen utvikling. I mus oppsto granule og Golgi celler mellom ~ E13 – E18 og gjennomgikk Terminal divisjoner opp til postnatal uke 4. Erstatte gamle medium jeg med fersk kultur medium II på dager in vitro (DIV) 7 vil til slutt hindre gliacellene c…

Discussion

Bruk av primære kulturer er en velkjent metode som gjelder for alle typer neurons^17,18,19. I den presenterte protokollen, forklarer vi hvordan å isolere lillehjernen neurons og opprettholde sin levedyktighet med optimal overlevelse in vitro for maksimalt 3 uker. Primær kultur av lillehjernen celler, som ble isolert ved E15-E18, bekrefter samlingen av tre klasser av store neurons: PCer, Golgi celler, og CNs. Cellen organer og …

Materials

Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager