배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리
1Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center,University of Louisville, 3Department of Medicine,University of Louisville, 4Department of Surgery,University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center,University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology,University of Louisville
Summary
이 연구는 배아 줄기 세포에서 면역 자극 과립 대세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외약 농축 세포 소포를 분리하는 방법을 설명합니다.
Abstract
배아 줄기 세포 (ESC)는 모든 유형의 배아 세포로 자가 재생 및 분화를 할 수있는 만능 줄기 세포입니다. 다른 많은 세포 유형과 마찬가지로, ESC는 외식과 같은 작은 막 소포를 세포 외 환경에 방출합니다. 엑소좀은 세포간 통신의 필수 중재자 역할을 하며 많은 (patho) 생리적 과정에 기본적인 역할을 합니다. 과립구-대식세포 식민지 자극 인자(GM-CSF)는 면역 반응을 조절하기 위해 사이토카인으로서 기능한다. 엑소좀에 GM-CSF의 존재는 면역 조절 기능을 높일 가능성이 있다. 여기서, GM-CSF는 뮤린 ESC 세포주 ES-D3에서 안정적으로 과발현되었다. 프로토콜은 GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포로부터 고품질 엑소좀 농축 세포 소포(EV)를 분리하기 위해 개발되었다. 고립 된 엑소좀 농축 된 전기는 다양한 실험적 접근법을 특징으로하였다. 중요한 것은, 상당한 양의 GM-CSF는 엑소좀 농축 된 전기 에 존재하는 것으로 나타났습니다. 전반적으로, ESC에서 GM-CSF 베어링 엑소좀 농축 된 전기 는 그들의 면역 규제 활동을 발휘 하기 위해 세포 없는 소포로 작동할 수 있습니다.
Introduction
ESC는 이식 전 배아1의배반성 단계에서 유래된다. 만능 줄기 세포로서, ESC는 배아 세포의 어떤 모형든지로 자기 갱신하고 분화할 수 있는 기능을 가지고 있습니다. 그들의 놀라운 발달 잠재력 및 장기 증식 능력으로 인해, ESC는 생물 의학 연구1에매우 귀중하다. 현재의 연구 노력은 주로 당뇨병, 심장 질환 및 신경 퇴행성 질환2,3,4를포함한 다양한 주요 병리학 적 질환에 대한 EsC의 치료잠재력에초점을 맞추고 있다.
ESC를 포함한 포유류 세포는 세포간 환경에 가변 크기로 소포를 방출하는 것으로 알려져 있으며, 이들 EV는 세포간 통신5에서의역할로 인해 많은 생리적 및 병리학적 기능을 갖는다. 이외 용이성 중에서도, 외형은 플라즈마 멤브레인6을가진 중간 내구, 다중 혈관 체납체(MVBs)의 융합시 세포외 공간으로 다양한 세포 유형에서 방출되는 작은 막 소포이다. 엑소좀은 세포간 통신을 중재하기 위해 보고되었으며 많은 (patho)의 생리적 과정에 비판적으로 관여하고있다7,8. 엑소좀은 단백질과 핵산을 포함한 사이토솔에서 획득한 생물학적 물질을 함유하고 있기 때문에 자신의 부모 세포로부터 일부 생물학적 기능을 상속합니다. 따라서, 주어진 질병에 특이적인 면역 반응을 자극하는 관련 항원 또는 인자는 특정 유형의 세포로부터 엑소좀에서 캡슐화된다9. 이는 항암 백신10으로종양 유래 엑소좀을 탐구하는 임상 시험을 위한 길을 열어주었다.
GM-CSF는 면역세포(11)의상이한 모형에 의해 분비되는 사이토카인이다. 새로운 증거는 GM-CSF가 면역 계통을 활성화하고 통제하고 항원 제시 프로세스12에서필수적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 임상 보고서는 GM-CSF가 백신보조제 13로서종양에 대한 면역 반응을 자극한다는 것을 시사한다. GM-CSF의 강력한 면역 자극 활성을 악용하기 위한 여러 GM-CSF 기반 암 면역 요법 전략은 임상 시험14에서조사되었다. 이들 중, 조사된 GM-CSF-분비 종양 세포로 구성된 암 백신은 전이 종양에서 세포 및 유머 항종양 반응 및 후속 괴사를 유도하여 고급 흑색종 환자에서 몇 가지 약속을 나타내고있다.
ESC에서 파생된 엑소솜은 원래 ESC와 유사한 생물학적 활동을 가지고 있기 때문에, 아마도 ESC에서 GM-CSF 운반 엑소좀은 면역 반응을 조절하기 위하여 세포 없는 소포로 작동할 수 있었습니다. 본 백서에서는 GM-CSF를 발현하는 ESC로부터 고품질 엑소좀 농축 전기자동차를 생산하는 상세한 방법이 설명되어 있다. 이 엑소좀 농축 된 전기 는 면역 반응을 조절하기 위해 면역 조절 소포역할을 할 가능성이 있습니다.
Protocol
1. ES-D3 세포 배양 외성 없는 태아 소 혈청(FBS)을 생성하려면 FBS를 4°C에서 16시간 동안 100,000 x g의 초원심분리기 및 원심분리기로 로드합니다. 원심분리에 따라, 뮤린 ESC 세포주 ES-D3를 배양하고 엑소좀 농축 된 전기를 획득하기 위한 외성 없는 FBS로서 혈청 상피물을 수집합니다. ES-D3 세포를 도금하기 전에 실온에서 젤라틴(0.1%)을 사용하여 15cm 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅?…
Representative Results
GM-CSF는 뮤린 ESC에서 과발현된다.ES-D3 세포에서 GM-CSF를 안정적으로 과발적으로 표현하기 위해, 뮤린 GM-CSF cDNA는 발현 벡터 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(도1A)를생성하는 형질 벡터로 복제되었다. GM-CSF는 ES-D3 세포에서 과발현되었고, 과도적으로 과도하게 감염된 ES-D3 세포의 약 20%가 GFP 양성이었다. 세포 클론은 GM-CSF 또는 빈 벡터 제?…
Discussion
이 연구는 면역 자극성 단백질 GM-CSF를 운반하는 외성 농축 된 전기를 생산하는 매우 효율적인 방법을 보여줍니다, 이는 외식 농축 된 EV의 면역 변조 효과를 연구하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇몇 연구 결과는 엑소좀이 면역 조절 및 항종양 기능을 전시한다는 것을 건의합니다22. 따라서, GM-CSF를 표현하는 ESCs에서 엑소솜은 또한 면역 반응을 통제하는 생물학 활동을 소유할 수 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전송 전자 현미경 이미지를 획득하기 위한 Arkadiusz Slusarczyk 및 켄터키 생물 의학 연구 인프라 네트워크 (KBRIN, P20GM103436)에 감사드립니다. 이 작품은 NIH AA018016-01 (J.W.E.), 켄터키 연구 챌린지 트러스트 펀드 (J.W.E.), NIH CA106599 및 CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), 무료 호흡 연구 (K.Y.)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Meng, S., Whitt, A. G., Tu, A., Eaton, J. W., Li, C., Yaddanapudi, K. Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (177), e60170, doi:10.3791/60170 (2021).