Denne undersøgelse beskriver en metode til at isolere exosome-beriget ekstracellulære vesikler transporterer immun-stimulerende granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktorer fra embryonale stamceller.
Embryonale stamceller (EPC’er) er pluripotente stamceller, der er i stand til selvfornyelse og differentiering i alle typer embryonale celler. Ligesom mange andre celletyper frigiver EFC’er små membran vesikler, såsom exosomer, til det ekstracellulære miljø. Exosomer tjener som væsentlige mæglere af intercellulær kommunikation og spiller en grundlæggende rolle i mange (pato)fysiologiske processer. Granulocyte-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) fungerer som en cytokin for at modulere immunresponset. Tilstedeværelsen af GM-CSF i exosomer har potentiale til at øge deres immunregulerende funktion. Her blev GM-CSF stukket overekspresset i murine ESC cellelinjen ES-D3. En protokol blev udviklet for at isolere exosomberigede ekstracellulære vesikler (EVs) af høj kvalitet fra ES-D3-celler, der overekspresserer GM-CSF. Isolerede exosome-berigede elbiler var karakteriseret ved en række eksperimentelle tilgange. Det er vigtigt, at betydelige mængder GM-CSF blev anset for at være til stede i exosome-berigede elbiler. Samlet set kan GM-CSF-bærende exosome-berigede elbiler fra EFC’er fungere som cellefrie vesikler til at udøve deres immunregulerende aktiviteter.
ESC’er er afledt af blastocyst fase af en præimplantation embryo1. Som pluripotente stamceller har ESC’er evnen til selv at forny og differentiere sig til enhver form for embryonale celler. På grund af deres bemærkelsesværdige udviklingspotentiale og langsigtede proliferative kapacitet er EFC’erne yderst værdifulde for biomedicinsk forskning1. Den nuværende forskningsindsats har i vid udstrækning fokuseret på EFC’ernes terapeutiske potentiale for en række større patologiske lidelser, herunder diabetes, hjertesygdomme og neurodegenerative sygdomme2,3,4.
Pattedyrsceller, herunder EPC’er, er kendt for at frigive vesikler med varierende størrelser til det ekstracellulære miljø, og disse elbiler besidder mange fysiologiske og patologiske funktioner på grund af deres rolle i intercellulær kommunikation5. Blandt forskellige undertyper af elbiler er exosomer små membran vesikler, der frigives fra forskellige celletyper i det ekstracellulære rum ved fusion af mellemliggende endoytiske rum, multivesicular organer (MVB’er), med plasmamembranen6. Exosomer er blevet rapporteret at mægle intercellulær kommunikation og er kritisk involveret i mange (pato)fysiologiske processer7,8. Exosomer arver nogle biologiske funktioner fra deres egne forældreceller, fordi exosomer indeholder biologiske materialer erhvervet fra cytosolen, herunder proteiner og nukleinsyrer. Således er de tilknyttede antigener eller faktorer, der stimulerer immunresponset, der er specifikt for en given sygdom, indkapslet i exosomer fra bestemte typer celler9. Dette banede vejen for kliniske forsøg udforske tumor-afledte exosomer som en anti-cancer vaccine10.
GM-CSF er en cytokin udskilles af forskellige typer af immunceller11. Nye beviser viser , at GM-CSF aktiverer og regulerer immunsystemet og spiller en væsentlig rolle i antigen-præsentationsprocessen12. For eksempel, en klinisk rapport tyder på, at GM-CSF stimulerer immunresponset på tumorer som en vaccine adjuvans13. Flere GM-CSF-baserede kræftimmunterapistrategier til udnyttelse af GM-CSF’s potente immunstimulerende aktivitet er blevet undersøgt i kliniske forsøg14. Blandt disse, en kræftvaccine bestående af bestrålet GM-CSF-udskillende tumorceller har vist nogle løfte i avancerede melanom patienter ved at fremkalde cellulære og humoristiske antitumor svar og efterfølgende nekrose i metastaserede tumorer15.
Fordi exosomer stammer fra EFC’er besidder lignende biologiske aktiviteter som de oprindelige EFC’er, måske GM-CSF-regnskabsmæssige exosomer fra EFC’er kunne fungere som cellefri vesikler til at regulere immunresponset. I dette papir beskrives en detaljeret metode til fremstilling af exosomeberigede elbiler af høj kvalitet fra EFC’er, der udtrykker GM-CSF. Disse exosome-beriget elbiler har potentiale til at tjene som immunregulerende vesikler til at modulere immunresponset.
Denne undersøgelse viser en meget effektiv metode til fremstilling af exosome-berigede elbiler, der bærer immunstimulerende protein GM-CSF, som kan anvendes til at studere immunmodulerende virkninger af exosome-berigede elbiler. Flere undersøgelser tyder på, at exosomer udviser immunregulerende og anti-tumor funktioner22. Eksosomer fra EFC’er, der udtrykker GM-CSF, kan således også have biologiske aktiviteter, der regulerer immunresponset. I denne protokol blev eksogen murin GM-CSF stukket o…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Mr. Arkadiusz Slusarczyk og Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) for at erhverve transmission elektron mikroskop billeder. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 og CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) og Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |