Isolement de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes transportant un facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages à partir de cellules souches embryonnaires
Summary
Cette étude décrit une méthode pour isoler des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes porteuses de facteurs de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires immunostimulants à partir de cellules souches embryonnaires.
Abstract
Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont des cellules souches pluripotentes capables de s’auto-renouveler et de se différencier en tous types de cellules embryonnaires. Comme beaucoup d’autres types de cellules, les CSE libèrent de petites vésicules membranaires, telles que des exosomes, dans l’environnement extracellulaire. Les exosomes servent de médiateurs essentiels de la communication intercellulaire et jouent un rôle fondamental dans de nombreux processus (patho)physiologiques. Le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) fonctionne comme une cytokine pour moduler la réponse immunitaire. La présence de GM-CSF dans les exosomes a le potentiel de renforcer leur fonction immunorégulatrice. Ici, gm-CSF a été surexprimé de manière stable dans la lignée cellulaire murine ESC ES-D3. Un protocole a été développé pour isoler des vésicules extracellulaires (VE) enrichies en exosomes de haute qualité à partir de cellules ES-D3 surexprimant le GM-CSF. Les véhicules électriques isolés enrichis en exosomes ont été caractérisés par une variété d’approches expérimentales. Il est important de se trouver des quantités importantes de GM-CSF dans les véhicules électriques enrichis en exosomes. Dans l’ensemble, les VE enrichis en exosomes porteurs de GM-CSF provenant de CES pourraient fonctionner comme des vésicules sans cellules pour exercer leurs activités immunorégulatrices.
Introduction
Les CSE sont dérivés du stade de blastocyste d’un embryon préimplantatoire1. En tant que cellules souches pluripotentes, les CSE ont la capacité de s’auto-renouveler et de se différencier en tout type de cellule embryonnaire. En raison de leur potentiel de développement remarquable et de leur capacité proliférative à long terme, les CES sont extrêmement précieux pour la recherche biomédicale1. Les efforts de recherche actuels se sont largement concentrés sur le potentiel thérapeutique des CSE pour une variété de troubles pathologiques majeurs, y compris le diabète, les maladies cardiaques et les maladies neurodégénératives2,3,4.
Les cellules de mammifères, y compris les CSE, sont connues pour libérer des vésicules de tailles variables dans l’environnement extracellulaire, et ces VE possèdent de nombreuses fonctions physiologiques et pathologiques en raison de leur rôle dans la communication intercellulaire5. Parmi les différents sous-types de VE, les exosomes sont de petites vésicules membranaires libérées par divers types de cellules dans l’espace extracellulaire lors de la fusion de compartiments endocytaires intermédiaires, de corps multivésiculaires (M MVB), avec la membraneplasmique 6. Il a été rapporté que les exosomes médient la communication intercellulaire et sont impliqués de manière critique dans de nombreux processus (patho)physiologiques7,8. Les exosomes héritent de certaines fonctions biologiques de leurs propres cellules parentales, car les exosomes contiennent des matériaux biologiques acquis à partir du cytosol, y compris des protéines et des acides nucléiques. Ainsi, les antigènes associés ou les facteurs stimulant la réponse immunitaire spécifique à une maladie donnée sont encapsulés dans les exosomes de types particuliers de cellules9. Cela a ouvert la voie à des essais cliniques explorant les exosomes dérivés de tumeurs en tant que vaccin anticancéreux10.
Gm-CSF est une cytokine sécrétée par différents types de cellules immunitaires11. De nouvelles preuves démontrent que le GM-CSF active et régule le système immunitaire et joue un rôle essentiel dans le processus de présentation de l’antigène12. Par exemple, un rapport clinique suggère que le GM-CSF stimule la réponse immunitaire aux tumeurs en tant qu’adjuvantvaccinal 13. Plusieurs stratégies d’immunothérapie du cancer à base de GM-CSF pour exploiter la puissante activité immunostimulatrice du GM-CSF ont été étudiées dans des essais cliniques14. Parmi ceux-ci, un vaccin anticancéreux composé de cellules tumorales sécrérant du GM-CSF irradiées s’est révélé prometteur chez les patients atteints de mélanome avancé en induisant des réponses antitumorales cellulaires et humorales et une nécrose ultérieure dans les tumeurs métastasées15.
Parce que les exosomes dérivés des CSE possèdent des activités biologiques similaires à celles des CES d’origine, peut-être que les exosomes porteurs de GM-LCR des CES pourraient fonctionner comme des vésicules sans cellules pour réguler la réponse immunitaire. Dans cet article, une méthode détaillée pour produire des VÉHICULES enrichis en exosomes de haute qualité à partir de CES exprimant gm-CSF est décrite. Ces VE enrichis en exosomes ont le potentiel de servir de vésicules immunorégulatrices pour moduler la réponse immunitaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude montre une méthode très efficace de production de VE enrichis en exosomes portant la protéine immunostimulatrice GM-CSF, qui peut être utilisée pour étudier les effets immunomodulateurs des VE enrichis en exosomes. Plusieurs études suggèrent que les exosomes présentent des fonctions immunorégulatrices etantitumorales 22. Ainsi, les exosomes des CSE exprimant le GM-CSF pourraient également posséder des activités biologiques qui régulent la réponse immunitaire. Dans ce pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à M. Arkadiusz Slusarczyk et au Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) d’avoir acquis des images au microscope électronique à transmission. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH AA018016-01 (J.W.E.), du Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), des NIH CA106599 et CA175003 (C.L.), nih CA198249 (K.Y.) et Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
Riferimenti
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