박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링
Summary
Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
J 도메인 단백질 (JDPs)은 진핵 세포에서 가장 크고 가장 다양한 코 샤페론 패밀리를 형성합니다. 최근 연구 결과에 따르면 JDP 패밀리의 특정 구성원은 진핵생물에서 일시적인 이종 복합체를 형성하여 70kDa 열 충격 단백질(Hsp70) 샤페론 계 단백질 다이그레그가스에 대한 기질 선택을 미세 조정할 수 있음을 보여줍니다. JDP 복합체는 급성/만성 스트레스 유발 응집 단백질을 표적으로 하고 아마도 단백질 응집체의 표면에 다중 Hsp70s를 모집하여 분리증을 조립하는 것을 돕습니다. 이러한 물리적으로 상호 작용하는 JDP에 의해 형성된 단백질 품질 관리(PQC) 네트워크의 범위는 생체 내에서 크게 특성화되지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 뚜렷한 세포 구획에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 복합체를 강력하게 포획할 수 있는 근접 결찰 분석법(PLA)이라는 이름의 현장 단백질 상호작용 분석법에 근거한 현미경 검사법을 기술한다. 우리의 일은 인간 세포에서 효모(Saccharomyces cerevisiae)와박테리아(대장균)로PLA의 고용을 확장하여 일시적으로 형성 된 단백질 어셈블리의 역학을 모니터링하는 중요한 도구가되었습니다. 시핵 세포와 진핵 세포.
Introduction
세포 상호 작용에 대한 우리의 불완전한 이해로 인해 광대한 양의 유전체 정보는 해석할 수 없습니다. 화학적 가교 및 단백질 공동 국소화가 없는 단백질 공동 면역 침전과 같은 기존의 단백질-단백질 상호 작용 검출 방법론은 널리 사용되지만 다양한 단점을 제기합니다. 주요 단점 중 일부는 상호 작용의 가난한 정량화 및 비 네이티브 바인딩 이벤트의 잠재적인 도입을 포함 합니다. 비교에서, 새로운 근접 기반 기술은 세포에서 단백질 상호 작용을 포착하기위한 대안과 강력한 접근 방식을 제공합니다. 근접 결찰 분석(PLA)1은 현재 독점 키트로 사용할 수 있으며, 상호 작용하는 하위 단위의 근접에 기초하여 단백질 복합체를 구체적으로 표적화하는 항체를 사용합니다.
PLA는 표적 단백질 복합체의 표면에 작은 DNA 태그(PLA 프로브)를 가진 1차 및 이차 항체로 구성된스캐폴드의 형성에 의해 개시된다(도 1, 단계 1-3). 다음으로, DNA 태그의 근접에 의해 결정되며, 원형 DNA 분자는 커넥터 올리고뉴클레오티드를 가진 혼성화를 통해 생성된다(도1,단계 4). 원형 DNA의 형성은 DNA 결찰 단계에 의해 완료된다. DNA의 새로 형성된 원형 조각은 공액된 올리고뉴클레오티드 태그 중 하나에 의해 프라이밍된 후속 압연 원형 증폭(RCA) 기반 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 템플릿역할을 한다. 이는 항체 스캐폴드를 통해 단백질 복합체에 부착된 단일 가선 형DNA 분자를 생성한다(도 1, 단계 6). 결합성 DNA 분자는 증폭된 DNA에 걸쳐 흩어져 있는 다중 고유 서열로 혼성화하는 형광표지된올리고뉴클레오티드를 사용하여 가시화된다(도 1, 단계 7)2. 생성된 PLA 신호는 형광점(도 1,단계 7)으로 나타나며, 세포 내의 표적 단백질 복합체의 위치에 대응한다. 그 결과, 분석은 높은 공간 정확도로 단백질 복합체를 검출할 수 있었습니다. 이 기술은 단순히 단백질 상호 작용을 포착하는 것뿐만 아니라 고감도1,2를가진 단백질에 대한 단일 분자 또는 단백질 변형을 검출하는 데에도 사용될 수 있다.
Hsp70은 다양한 하우스키핑 및 스트레스 관련 기능에 참여하여 세포 단백질 항상성을 유지하는 데 근본적으로 중요한 매우 다재다능한 샤페론 시스템을 형성합니다. Hsp70 샤페론 시스템의 하우스키핑 활동은 드 노보 단백질 폴딩, 세포막에 걸친 단백질 전좌, 단백질 복합체의 조립 및 분해, 단백질 활성 조절 및 다양한 단백질 폴딩 연결/ 품질 관리 기계3. 동일한 샤페론 시스템은 또한 잘못 접히고/ 전개된 단백질을 다시 접고, 단백질 응집을 방지하고, 단백질 분해를 촉진하고, 세포 단백질을 분해하여 말기 잘못 접히지/손상된 단백질을 분해하여 세포 복구를 용이하게 합니다. proteotoxic 스트레스4,5. 이러한 기능적 다양성을 달성하기 위해 Hsp70 샤페론은 JDP 제품군과 뉴클레오티드 교환 인자(NEF)의 공동 샤페론과 협력하여 Hsp70의 ATP 의존적 알로스테릭 제어를 미세 조정하여 기질 결합 및 방출3, 6. 또한 JDP 코샤페론은 이 다재다능한 샤페론 시스템을 위한 기판을 선택하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 가족의 구성원은 프로토 타입 JDP, 대장균 DnaJ에 자신의 구조적 상동성에 따라 세 가지 클래스 (A, B 및 C)로 세분화된다. 클래스 A JDPs는 Hsp70, 글리신 페닐알라닌 리치 영역, 아연 핑거상 영역(ZFLR) 및 2개의 β 배럴 도메인으로 구성된 기질 결합 영역및 C-말단 이화 도메인과 상호 작용하는 N-말단 J 도메인을 포함합니다. N 말단 J 도메인과 글리신 페닐알라닌 부유 한 영역을 가진 JDP, 하지만 ZFLR 부족, 클래스 B에 빠진다. 일반적으로 이 두 클래스의 구성원은 보호 기능에 관여합니다. J-도메인 4만 공유하는 JDP가 포함된 캐치올 클래스C에 속하는 회원은 Hsp70s를 모집하여 다양한 비보호자 기능을 수행합니다. Hsp70 시스템의 교환 가능한 기판 인식 “어댑터”로서 JDP의 중요한 역할은 진화 하는 동안 가족 구성원의 확장에 의해 반영 됩니다. 예를 들어, 인간은 42 개이상의 별개의 JDP 회원 4. 이러한 JDP는 단량체, 호모 및 / 또는 호모/ 헤테로 올리고머로 기능 4,5. 최근, 클래스 A 사이의 일시적인 복합형성을 통한 기능적 협력(예를 들어, H. Sapiens DNAJA2; S. 세레비시아Ydj1) 및 B급(예를 들어, 에이치사피엔스 DNAJB1; S. 세레비시아Sis1) 진핵 JDPs는 시험관 내 무정형 단백질 응집체의 효율적인인식을 촉진시키는 것으로 보고되었다 7,8. 이러한 혼합 클래스 JDP 복합체는 아마도 Hsp70- 및 Hsp70+Hsp100 기반 단백질 분해제 7,8,9의 형성을 용이하게 하기 위해 응집된 단백질의 표면에 조립됩니다. 10.진핵 세포에서 이러한 과도적으로 형성된 혼합형 JDP 복합체의 존재를 뒷받침하는중요한 증거는 PLA 8을 구비하였다.
PLA는 주로 포유류 세포에서 메타조아에서 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 점점 더 많이 사용됩니다. 여기에서, 우리는 신진 효모 S. cerevisiae 및 박테리아 대장균과 같은 진핵과 원핵 세포 단세포 유기체에 있는 일시적으로 형성된 chaperone 복합체를 감시하기 위하여 이 기술의 성공적인 확장을 보고합니다. 중요한 것은, 이 확장은 인간과 동물 세포를 감염시키는 미생물을 검출하고 분석하기 위한 PLA의 잠재적인 사용을 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공동 면역 침전 및 공동 국소화 기반 접근법은 단백질 조립을 특성화하는 오랜 방법으로 사용되어 왔다. 과도하게 형성된 특정 샤페론 복합체의 검출은 이러한 전통적인 방법의 주요 과제이며, 그 결과, 이전의 발견은 주로 질적 해석으로 제한된다. 세포 용해 기지를 둔 공동 면역 침전 기술은 수시로 단백질 단백질 상호 작용을 안정시키기 위하여 가교를 요구합니다. 세포 용해는 일시적으로 형?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NBN은 빅토리아 주 정부와 호주 정부의 자금으로 모나시 대학 의학 간호 및 건강 과학 학부의 특별 모집 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 베른트 부카우 (ZMBH, 하이델베르크 대학, 독일) 및 Harm H. Kampinga (세포 및 시스템 학과, 그로닝겐 대학, 네덜란드) 시약의 귀중한 지원과 공유에 감사드립니다, 홀거 로렌츠 (ZMBH) 이미징 시설, 하이델베르크 대학, 독일) 공초점 현미경 및 이미지 처리와 그의 지원에 대한, 클레어 허스트 (ARMI, 모나시 대학, 호주) 원고의 비판적 독서.
Materials
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
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